［摘要］为研究不同切应力下内皮细胞条件培养基对平滑肌细胞和胶原合成的影响，建立平行平板流动腔模型，模拟产生定常层流，采用³H-胸腺嘧啶核苷掺入法和胃蛋白酶消化法，测定细胞DNA和胶原合成量。实验发现，与单用10%牛血清DMEM培养基比较，静态培养的内皮细胞条件培养基促使平滑肌细胞 DNA和胶原合成，³H-胸腺嘧啶核苷掺入量从749±53 cpm/10³细胞上升至1 202±63 cpm/10³ (P＜0.01)，平滑肌细胞掺入2,3-³H-羟脯氨酸量从30±6cpm/10³细胞上升至47±4 cpm/10³细胞(P＜0.01)。内皮细胞在10和25 dyn/cm²切应力剪切18 h后，内皮细胞条件培养基对平滑肌细胞DNA和胶原合成促进效应分别下降了10.41%±5.66%、 23.97%±6.23%和45.71%±2.93%、64.53%±2.42% 。由此提示内皮细胞所受血流切应力减小后，其条件培养基能促使平滑肌细胞的增殖和胶原合成。

［中图分类号］R331.32［文献标识码］A

［文章编号］1007-3949(2000)-03-0206-03

Effect of Supernatant of Endothelial Cells Exposed to Laminar Flow on Small Muscle Cells Proliferation and Collagen Synthesis

HAN Lin，ZHANG Bao-Ren，ZHU Jia-Lin

(Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

ABSTRACTAimTo establish whether the changes of local blood flow involved in the vessel wall remodeling, we investigated the effects of culture medium conditioned with endothelial cells exposed to hemodynamic shear forces on modulation of smooth muscle cells(SMC) proliferation and collagen synthesis.MethodsSMC were isolated and cultured with collagenase digestion.Confluent monolayers of EC were exposed to static or to laminar flow conditions for 24 h using a parallel-plated flow chamber.Endothelial cell-conditioned medium was used to study the growth of PASMC by ³ H-thymidine uptake and collagen synthesis of PASMC using 2,3-³ H－proline incorporation into ³ H hydroxyproline.Results The proliferative response of SMC to culture medium from endothelial cells under static flow is higher than to fresh medium(1 202±63 cpm/10³ cells vs. 749±53 cpm/103 cells, P＜0.01).SMC synthesized more collagen cultured with medium from endothelial cells under static flow than fresh medium(47±4 cpm/10³cells vs． 30±6 cpm/10³ cells， P＜0.01). In contrast, medium conditioned with endothelial cells exposed to shear stress of 10 dyn/cm² and 25 dyn/cm² after 18 h reduced SMC DNA and collagen synthesis by 10.41%±5.66%, 23.97%±6.23% and 45.71%±2.93%, 64.53±2.42% comparison with medium from endothelial cells under static flow.ConclusionsOur experimental results showed lower shear stress led to enhance the underlying SMC proliferation and collagen synthesis.It suggests a steady level of shear stress acting on artery plays an important role of preventing it of remodeling.

MeSHEndothelials;Shear Stress;Muscle， Smooth;Collagen Synthesis;Vessel Wall Remodeling;Parallel Plated Flow Chamber

在机体循环系统中，血液流动对血管表面产生的切应力不仅影响内皮细胞的形态，而且调控内皮细胞内生物活性物质的基因表达，其在维持正常血管生理和参与多种心血管疾病发生发展中的意义日益受到重视^［1,2］。本实验通过体外培养内皮细胞（endothelial cell， EC）和平滑肌细胞（smooth muscle cell, SMC），建立平行平板流动腔模型，观察在不同大小切应力作用下内皮细胞条件培养基（endothelial cell-conditioned medium, EC-CM）对平滑肌细胞增殖和胶原合成的影响，以进一步探讨血流变化对血管构建重组的影响。

1材料和方法

1.1内皮细胞的培养和鉴定

用0.1%胶原酶（Ⅱ型）消化法分离培养小牛肺动脉内皮细胞，相差显微镜下观察细胞形态，凝血Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测以鉴定培养的细胞。第4～7代细胞用于实验，内皮细胞接种于110 mm×70 mm×10 mm玻璃平板，细胞长满后2天用于剪切实验。

1.2平滑肌细胞的培养和鉴定

用0.2%胶原酶（Ⅱ型）消化法分离培养小牛肺动脉肌条，根据细胞形态、生长特点及超微结构鉴定培养的细胞。第5代细胞用于实验。

1.3平行平板流动腔的建立和使用

本实验装置由流室、灌流辅助系统、混合气体供应部分和恒温生化培养箱组成。流室是由聚碳酸酯平板附以厚为0.2 mm矩形硅胶垫圈，通过真空吸附铺有培养内皮细胞的玻璃平板组成，规格80 mm×45 mm×0.2 mm；灌流辅助系统由上、下两只特制的玻璃贮液瓶、硅胶管和恒流泵组成，上、下贮液瓶之间的高度差（H）决定通过流室内的流量(Q)，恒流泵维持灌流液循环，灌流液为无血清改良Eagles培养基（DMEM），总量为25 mL；混合气为95%空气+5% 二氧化碳。流室内内皮细胞所受切应力根据如下公式计算: τ=ρvhH/2L，其中ρ为灌流液密度，v为加速度，h为流室高度，L为流室腔长度。

流室、灌注管道和贮液槽预先经高压灭菌，于37℃ SHH 生化培养箱内无菌条件下进行装配和使用。分别在10、15和25 dyn/cm² 切应力下作用18 h 后，收集灌流液，1000 g离心5 min，取上清液用于下一步实验。

1.4平滑肌细胞增殖和胶原合成量的测定

平滑肌细胞以4×10⁴接种于6孔培养皿，2天后长成单层融合，吸弃培养基，用Hanks液轻洗三遍，用无血清DMEM培养基培养24 h，各孔换入各组条件培养基1 mL，37℃培养24 h，测试DNA合成组加入³ H-胸腺嘧啶核苷培养4 h，测试胶原合成组加入2,3-³H-脯氨酸培养3 h，收集细胞及培养基，按文献［3，4］介绍的方法测定细胞DNA和胶原的合成量。

1.5统计学处理

结果均以±s表示，采用未配对资料的t检验。

2结 果

2.1肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞培养和鉴定

光镜下见培养的内皮细胞呈多角形，单层生长达到融合后，呈鹅卵石样排列；凝血Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ R∶Ag)检测见内皮细胞核周胞浆呈紫褐色颗粒分布。平滑肌细胞多为长梭形，稀疏生长时少数可呈多角形，电镜下见靠近细胞膜处有丰富的致密斑和与细胞长轴平行的肌丝束。

2.2内皮细胞条件培养基对平滑肌细胞增殖的影响

平滑肌细胞用静息状态内皮细胞条件培养基与用DMEM培养基培养24h比较，前者平滑肌细胞的³H-胸腺嘧啶核苷掺入量明显增加（1 202±63 cpm/10³细胞比749±53 cpm/10³细胞， P＜0.05）。在静息状态内皮细胞条件培养基培养的³H-胸腺嘧啶核苷掺入量为100%，在切应力分别为10、15和25 dyn/cm²作用后的内皮细胞条件培养液培养的³H-胸腺嘧啶核苷掺入量分别下降了10%±5%、23%±7%和23%±6%（P＜0.01）。

2.3内皮细胞条件培养基对平滑肌细胞合成胶原的影响

平滑肌细胞用静息状态内皮细胞条件培养基与用DMEM培养基培养24h比较，2,3-³H-脯氨酸掺入平滑肌细胞合成2,3-³H-羟脯氨酸的量明显升高（30±6 cpm/10³细胞比47±4 cpm/10³细胞， P＜0.01），细胞分泌入培养基中胶原量也相应升高（2.1±0.5 比 5.3±0.6， P＜0.01）。然而平滑肌细胞在剪切作用后的内皮细胞条件培养基培养后，细胞合成2,3-³H-羟脯氨酸的量和分泌的胶原量明显受到抑制，并随切应力的增大而增强（表1，Table 1)。

3讨 论

内皮细胞和平滑肌细胞是构成血管壁的两种主要细胞，前者可合成和分泌多种生物活性因子，以调节平滑肌细胞的舒缩、增殖和细胞外基质的合成。构成血管壁内膜的内皮细胞始终处于不断流动的血液环境中，很早以前，人们提出血流参与调节血管发育和生长的假设，并认为局部血流环境的紊乱参与许多血管疾病的病理生理过程，但其机制尚不明确^［1］。本实验研究的切应力是构成血流流动特性的主要因素，是血液流动作用于血管内膜的摩擦力，内皮细胞是受力细胞，在正常生理条件下大血管中内皮所受的切应力为20～25 dyn/cm²，我们采用离体的平行平板流动腔模型研究定常层流作用于内皮细胞的切应力, 实验结果发现，与<