［摘要］为研究主动脉中膜细胞体外钙化情况以及25-羟基胆固醇对此过程的促进作用，采用贴块法分离培养主动脉中膜细胞，并进行von Kossa染色以显示钙化，生物化学检测细胞不溶性钙，放射免疫法测定培养上清液中骨钙素含量。发现原代细胞有两种生长表现：一种细胞平行生长，不形成结节，von Kossa染色阴性；另一种易形成结节，von Kossa染色阳性。对照组传代细胞培养28天无结节形成，von Kossa染色阴性。而实验组，即25-羟基胆固醇处理组有细胞结节形成，von Kossa染色阳性，培养上清液中骨钙素增多。由此可见体外培养的主动脉中膜细胞有两种亚型，一种为平滑肌细胞的表型；另一种为微血管周细胞型细胞，能使其细胞外基质钙化。25－羟基胆固醇可以促进这一体外钙化过程。周细胞型细胞钙化过程中骨钙素合成增多，推测骨钙素可能参与了主动脉的钙化。

［中图分类号］R54［文献标识码］A

［文章编号］1007-3949（2000）-03-0199-03

25-Hydroxycholesterol Accelerates in Vitro Calcification of Rabbit Aortic Medial Cells

CUI Xiao-Xuan

(Air Force General Hospital, Beijing 100853， China)

WANG Shi-Wen，QI Peng

(Institute of Geriatric Cardiology, General Hospital of PLA)

ABSTRACTAim To investigate in vitro calcification of aortic medial cells and the acceleration by 25-hydroxycholesterol. Methods Aortic medial cells were obtained by explantation. Von Kossa staining was performed to show calcification. Insoluble calcium of cellular layer was determined by biochemical method. And osteocalcin in the media was analyzed with radioimmunoassay. Results Primary cells appeared two different types: cells with the features of parallel growth and negative von Kossa staining, and cells forming nodules with positive von Kossa staining. Passaged cells formed no nodules after 28 days. Cells treated with 25-hydroxycholesterol appeared many cell nodules with positive von Kossa staining. Both insoluble calcium and medium osteocalcin increased significantly. Conclusions There are two subgroups of the cultured aortic medial cells: one with the characters of smooth muscle cells; the other like micro vascular pericytes, which can calcify the extracellular matrix. 25-hydroxycholesterol can promote in vitro calcification. Osteocalcin secretion increases during pericyte-like cell calcification, suggesting that osteocalcin may take part in aortic calcification.

MeSHAorta； Calcification； 25-Hydroxycholesterol；Muscle, Smooth; Pericyte；Osteocalcin

动脉钙化不但会增加心肌梗死和心力衰竭的发生风险，而且显著增加介入性治疗中严重合并症的发生，研究心血管系统异位钙化的发生机理，能为动脉钙化的早期预防及临床治疗提供理论基础。本研究对长期培养的原代及传代家兔主动脉中膜细胞体外钙化情况以及25-羟基胆固醇对此过程的促进作用进行了观察。

1 材料与方法

1.1材 料

新西兰家兔由中国药品生物制品检定所实验动物繁育场购得。骨钙素测定放射免疫药盒由北京东亚免疫技术研究所购得。Hanks液（GIBCO-BEL），DMEM培养基（GIBCO-BEL），精制胎牛血清（Hyclone）。

1.2平滑肌细胞的分离和培养

无菌分离出家兔主动脉，在Hanks液中反复冲洗主动脉条，并用钟表镊撕掉主动脉外膜。纵向剖开，用消毒棉签擦拭内膜面的内皮细胞。用贴块法分离培养血管平滑肌细胞。将培养瓶置于37℃5% CO₂培养箱中，30min～1h后取出，加入含有20%FBS、100ku/L青霉素、100 mg/L链霉素和2 mmol/L谷胺酰胺的DMEM，37℃ 5% CO₂培养。每3天换一次液。

1.3实验分组

培养的第5～6代细胞在含有10%FBS、100 ku/L青霉素、100 mg/L链霉素和2 mmol/L谷胺酰胺的DMEM中按1.8×10⁵/孔的密度接种于6孔培养板。25-羟基胆固醇处理组(简称处理组)细胞72 h后更换为添加有1 mg/L 25-羟基胆固醇的上述培养基，而对照组细胞培养基中不添加25-羟基胆固醇。每3天换一次液。

1.4von Kossa钙染色及钙测定

培养的细胞在0.1%戊二醛中固定30 min。加入5％硝酸银，蔽光、室温孵育30 min。用三蒸水轻轻洗涤细胞后，在紫外光下放置30 min。用0.1%伊红复染30 s。钙沉积染成黑色。

为测定结合于细胞外基质、细胞蛋白和矿物质的不溶性钙，将已生长于6孔培养板的细胞在钙测定前的12 h更换成不含血清的培养基。用PBS冲洗，用胰蛋白酶消化后铲下细胞。加入1.5 mL PBS并收集细胞,38℃下孵育细胞30 min。经过3个冷冻→融解循环后，再次在38℃下孵育30 min。将细胞置于超声波中3 min，使细胞充分破碎。3 000 g离心30 min，沉淀被完全悬浮于250 μL 6 mol/L HCl中，100℃孵育30 min，加入250 μL 6 mol/L NaOH进行中和。其余步骤按Webster方法^［1］操作。

1.5骨钙素测定

每个培养孔中加入1.5 mL培养基，孵育72 h后吸出上清液，置于－30℃保存。骨钙素的浓度用¹²⁵ I放射免疫法按试剂盒说明进行分析。

1.6统计学处理

所得数据以平均值±标准差（±s）表示，用t检验进行统计学分析，以P＜0.05为统计学差异显著。

2 结 果

2.1培养细胞的生长及von Kossa染色特征

原代细胞在培养至21天时，镜下可见两种不同形态的细胞生长。一种为长梭形，平行生长，束状排列，密集与稀疏处相互交错呈“峰－谷”状；另一种为扁而大的星形细胞，即使在稀疏的生长状态下，仍然形成多个细胞结节，细胞生长不能铺满瓶底汇合成单层。用von Kossa法对沉积的钙质进行染色，细胞结节被染成黑色显示有钙质沉积。传代培养的细胞，培养至28天，对照组无细胞结节形成，von Kossa染色阴性（图1A，Figure 1A）；而25-羟基胆固醇处理组的细胞可见多个细胞结节，von Kossa染色阳性（图1B， Figure 1B）。

图1Von Kossa染色.A: 对照组细胞培养28天，无细胞结节形成，von Kossa染色为阴性 (×100)；B： 25-羟基胆固醇处理组细胞培养28天，可见细胞结节形成，von Kossa染色为阳性(×200)

Figure 1von Kossa stain.A： Cells of control group showed no cellular nodule formation and negative von Kossa stain （×100）；B： Cells treated with 25-hydrocholesterol showed cellular nodules formation and positive von Kossa stain (×200)

2.2钙测定

25-羟基胆固醇处理组钙含量为0.0578±0.0185 mg，明显高于对照组0.000104±0.000032 mg(P＜0.001)。

2.3骨钙素的测定

25-羟基胆固醇处理组骨钙素为0.8863±0.0625 μg/L，高于对照组0.6846±0.0389 μg/L（P＜0.001）。

3讨 论

3.1主动脉血管壁细胞的钙化

我们用主动脉中膜外植块进行细胞的原代培养，发现从组织块外周长出的细胞表现为两种不同的细胞形态和生长状态。一种细胞为典型的平滑肌细胞的表现，另一种细胞的生长和钙化的特点与微血管的周细胞（pericytes）十分相似。Schor等^［2］对视网膜微血管周细胞的观察发现，即使在稀疏培养中周细胞仍趋向于重叠、聚集，周细胞是通过不断重复着贴壁、伸展、增殖和收缩这个循环而使细胞结节增大。结节的间质内含有胶原纤维和基质小泡，针状的羟基磷灰石在间质内沉积，并逐渐发展为结节的广泛钙化。

由于我们在原代培养中见到平滑肌细胞型和周细胞型两种细胞生长方式，并且在培养21天后前者不发生钙化而后者出现明显的钙化，因而我们认为主动脉中膜内存在一种周细胞型的细胞，正是这种细胞在血管壁的钙化过程中起着重要作用。Andreeva等^［3］用免疫细胞化学的方法用抗周细胞抗体3G5研究了周细胞型细胞在成年人血管床的分布，发现周细胞型细胞分布于大、中、小动脉的内皮下层、中膜外层和外层滋养血管，且为星形。

在我们的实验中，传代培养的细胞在未施加促钙化因素的条件下，其钙化速度明显慢于原代细胞，培养至28天时仍未见钙化结节出现。推测其