［摘要］为探讨血管再狭窄发生过程中血浆组织型纤溶酶原激活物及其抑制剂活性与胶原转换及骨桥蛋白基因表达的变化，采用发色底物法检测组织型纤溶酶原激活物及其抑制剂活性；应用Northern 印迹观察骨桥蛋白基因表达活性。结果表明，大鼠主动脉内皮剥脱后3天，血浆组织型纤溶酶原激活物活性开始升高，第7天达高峰，由对照组的296.1±120.2 IU/L上升为856.2±195.3 IU/L，之后随内皮剥脱时间的延长虽有所下降，但在所观察的时间范围内，均显著高于对照水平（P＜0.05）。羟脯氨酸测定结果显示，内皮剥脱后3天血管壁胶原降解开始增加，第7天达高峰，是对照组的1.6倍。此外，大鼠主动脉内皮剥脱诱导了骨桥蛋白基因表达，内皮剥脱后3天其表达活性为对照组的5倍。提示在血管再狭窄发生过程中，血浆组织型纤溶酶原激活物和骨桥蛋白参与血管重构过程。

［中图分类号］R543.1［文献标识码］A

［文章编号］1007-3949(2000)-02-0096-03

The Changes of Plasma Tissue Plasminogen Activator and its Inhibitor Activity and Collagen Turnover during Vascular Restenosis Development

ZHOU Xiu-Xia， WEN Jin-Kun， and HAN Mei

(Department of Biochemistry, Institute of Basic Medicine, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)

ABSTRACTAim To explore the changes of plasma tissue plasminogen activator (tPA), plasminogen activator inhibitor (PAI) activity，collagen degradation and osteopontin gene expression during vascular restenosis development. Methods The activities of tPA and PAI were measured by tPA and PAI kits， Northern blotting was used to detect osteopontin gene expression. Results The activity of tPA increased at 3 d after de-endothelization, and peaked at 7 d , the level of tPA increased from 296.1±120.2 IU/L (control group) to 856.2±195.3 IU/L (7 d). The results of hydroxyproline concentration showed that the collagen degradation increased at 3 d and peaked at 7 d after de-endothelialization, about 1.6 times compared with the control. Osteopontin gene expression was remarkably induced by de-endothelization, the peak expression was at 3 d after operation, and was about 5 times comparing with the control, then osteopontin gene expression decreased and returned to the control level at 14 d after operation. Conclusions Osteopontin, collagen turnover and tPA take part in the process of vascular remodeling during vascular restenosis development.

MeSHVascular Restenosis；Osteopontin；Alteplase；Plasminogen Activator Inhibitor；Collagen

血管内皮损伤所引发的中膜血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）增殖、向内膜下迁移及分泌细胞外基质（extracelluar matrix, ECM）是血管成形术后再狭窄的病理基础。已经证明，VSMC从中膜向内膜迁移除需要对ECM进行降解外，还需要ECM中的粘附蛋白—骨桥蛋白的介导^［1］。近年发现，VSMC合成与分泌的丝氨酸蛋白酶（如纤溶酶）和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）均可降解ECM^［2］。在正常情况下，两类蛋白酶均以酶原形式存在，纤溶酶原被组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）激活后，既可直接作用于ECM，又可通过激活MMP而间接对ECM发挥降解作用，因此，tPA及其抑制剂（plasminogen activator inhibitor，PAI）对ECM降解具有重要调节作用。了解血管再狭窄发生过程中骨桥蛋白基因表达和tPA、PAI活性变化的规律，对进一步认识血管再狭窄的发生机制具有重要意义。

1材料和方法

1.1材料

雄性SD大鼠，体重300～350 g，由河北省实验动物中心提供，骨桥蛋白cDNA探针为本室保存，随机引物标记试剂盒为Promega公司产品，α-³² P-dCTP购自北京亚辉生物医学公司，血浆tPA、PAI测定试剂盒由上海亚都生物技术公司提供，其它试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 大鼠主动脉内皮剥脱模型的制备

参照Bendeck等^［3］方法制备，分别于术后第3、7、14及21天取血分离血浆，取损伤部位血管分别用于总RNA提取及胶原降解测定，每个时间点标本数为6，对照组行左颈总动脉结扎术。

1.3血浆组织型纤溶酶原激活物及其抑制剂活性测定

分别于内皮剥脱后第3、7、14及21天从大鼠心脏取血，置于含1/10体积抗凝剂（0.109 mmol/L枸橼酸钠）的试管中， 混匀，4℃，3 000 r/min离心10 min，分离血浆，用发色底物法测定tPA和PAI活性。

1.4 羟脯氨酸含量测定

按文献［4］方法，将损伤部位血管经丙酮-乙醚 (1∶1) 脱脂、干燥后称取3～5 mg，加0.9%NaCl制成匀浆，用2 mol/L HCl调pH值至2～2.5，胃蛋白酶消化72 h， 加50 μL 1 mol/L pH 8.0的 Tris-Cl 终止反应后，加入200 μL 1.2 mol/L高氯酸，4 000 r/min离心10 min，上清即为降解的小分子胶原。置110℃烤箱干燥后，6 mol/L HCl 110℃水解24 h，4 mol/L NaOH 调pH值至5.0～7.0，定容，过滤。取滤液0.2 mL，加入0.5 mol/L氯胺T 0.5 mL，室温氧化6 min，高氯酸终止反应。加入0.5 mL 10%对二甲氨基苯甲醛，75℃～80℃显色20 min，冷却后于波长560 nm比色测定羟脯氨酸含量。

1.5 Northern 印迹分析

用异硫氰酸胍一步法^［5］分别从对照及内皮剥脱不同时间的大鼠主动脉中提取RNA，各取30 μg，进行1%琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳，转移至尼龙膜上后，按文献［6］方法与用随机引物法标记的骨桥蛋白 cDNA探针进行杂交及放射自显影。

1.6 统计学方法

实验结果用±s表示，组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1 血浆组织型纤溶酶原激活物及其抑制剂活性的变化

大鼠血浆tPA活性于主动脉内皮剥脱后3天开始升高，第7天达高峰，之后随内皮剥脱时间的延长，tPA活性逐渐下降，但在所观察的时间范围内，各时间点的tPA活性均显著高于对照组(P＜0.05)。在本实验条件下，各时间点的血浆PAI活性虽有所升高，但无统计学意义（图1，Figure 1）。

图1. 血管内皮剥脱后血浆组织型纤溶酶原激活物及其抑制剂活性的变化

Figure 1. The changes of plasma tPA and PAI activity in control and de-endothelialized rats. a: P＜0.05, compared with the control.tPA: IU/L; PAI: AU/L.

2.2胶原降解的变化

胶原降解于大鼠主动脉内皮剥脱后3天开始增加，第7天达到高峰，分别为对照组的1.3倍和1.6倍。之后，随内皮剥脱时间延长，胶原降解程度逐渐减低。内皮剥脱后14天及21天胶原降解略高于对照组，无统计学差异（图2, Figure 2）。

图2. 血管内皮剥脱后胶原降解的测定.

Figure 2. Measurement of collagen degradation in control and de-endothelialized rat aortas. a: P＜0.05, compared with the control.

2.3 骨桥蛋白基因表达活性的变化

如图3（Figure 3）所示，从对照和内皮剥脱不同时间的主动脉提取的RNA与骨桥蛋白cDNA探针杂交后，在18S附近出现一条杂交区带。从杂交信号的强度可知，对照血管骨桥蛋白表达活性很低，而主动脉内皮剥脱后该基因的表达被显著诱导，于术后第3天达到高峰，其强度约是对照组的5倍，之后其表达活性逐渐下降，术后第7天为对照组的2.7 倍，第14天恢复到对照水平。

图3. 血管内皮剥脱后骨桥蛋白基因表达的变化.

Figure 3. Northern blot analysis of osteopontin mRNA expression in control and de-endothelialized rat aorta．A ： autoradiogram； B： densitometric scanning.

3 讨 论

正常情况下，动脉壁中层的VSMC<