［摘要］为了研究高密度脂蛋白3介导大鼠腹腔巨噬细胞内胆固醇流出的机理，用N-乙酰咪唑修饰高密度脂蛋白3，阻断其与细胞表面受体的结合，观察细胞内胆固醇流出。用异硫氰酸荧光素酯标记高密度脂蛋白3，示踪其在细胞内的代谢。结果发现牛血清白蛋白（对照组）介导2.87%细胞内胆固醇流出，高密度脂蛋白3组和N-乙酰咪唑-高密度脂蛋白3组分别为40.68%和8.69%。异硫氰酸荧光素酯-高密度脂蛋白3与细胞在37℃共育3 h后，细胞内吞荧光强度占结合的65.0%，细胞在37℃继续培养2 h后，细胞释放的荧光强度占内吞的78.4%，并且内吞和释放的荧光强度均主要存在于三氯醋酸沉淀部分。结果提示高密度脂蛋白3通过与细胞表面受体作用进入细胞，在细胞内不经过溶酶体途径降解，而是接受细胞内胆固醇后通过逆胞饮形式释放到细胞外。

［中图分类号］Q548.1［文献标识码］A

［文章编号］1007-3949(2000)-02-0111-04

Cholesterol Efflux from Macrophages Mediated by High Density Lipoprotein-3

CHEN Pei-Fang, LI Jian-Jun, WU Man-Ping, LOU Bin， and YANG Xiao-Qi

(Department of Biochemistry, School of Pharmacy, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)

ABSTRACTAimTo study the mechanism of cholesterol efflux from rat peritoneal macrophages mediated by high density lipoprotein-3(HDL₃).MethodsModification of HDL₃ by N-acetylimidazole blocked interaction between HDL and its cellular receptor.FITC labeled HDL₃ were used to observed the cellular metabolic process of HDL₃.ResultsBSA (control group) mediated 2.9% cellular cholesterol efflux from the cells.In HDL₃ group and N-acetylimidazole-HDL₃ group,they were 40.7% and 8.7% respectively.After incubation of macrophages with FITC-HDL₃ at 37℃for 3h, the cell-endocytic fluorescence strength (FS) was 65.0% of the cell-associated FS.When the cells were further incubated with blank media at 37℃for 2h, 78.4% of the cell-endocytic FS was released into the media.Both the cell-endocytic FS and the cell-released FS were mainly in trichloroacetic acid precepitable form.ConclusionsThe cellular cholesterol efflux from macrophages mediated by HDL₃ was HDL receptor-dependent.The possible mechanism could be that macrophages internalized HDL₃ by HDL receptor.HDL₃ picked up cellular cholesterol and was resecreted out of cells by a retroendocytic pathway without taking a celluar lysosomal phathway.

MeSHMacrophages，Peritoneal;Cholesterol ; Lipoprotein，HDL;Endocytosis;Fluorescence Isothiocyanate；Rat

高密度脂蛋白3（high density lipoprotein-3, HDL₃）具有抗动脉粥样硬化作用，主要是因为其参与了胆固醇（cholesterol）逆转运。胆固醇逆向转运包含三个步骤：①胆固醇从肝外细胞流出，被HDL₃接受；②在血浆中卵磷脂：胆固醇酰基转移酶催化下，胆固醇转变成胆固醇酯，使HDL₃转化成富含胆固醇酯的HDL₂；③肝脏选择性摄取HDL₂中胆固醇酯。其中第二步胆固醇酯化反应过程早已阐明，第三步肝脏选择性摄取HDL₂中胆固醇酯的机理，我们已作了研讨^［1］。但关于第一步HDL₃介导细胞内胆固醇流出的机理，至今尚未阐明，有几种代表观点：① 胆固醇通过简单扩散透过细胞膜，进入细胞间液与HDL结合并被运走^［2］；②细胞上HDL受体介导细胞内胆固醇流出^［3］；③细胞内胆固醇流出是由HDL中脂质部分介导的^［4］；④HDL中两种组分，即载脂蛋白与脂质部分均参与了细胞内胆固醇的流出^［5］。本研究将以大鼠腹腔巨噬细胞为对象来探讨细胞内胆固醇流出的机理。

1材料与方法

1.1材 料

健康人血由上海市中心血站提供。Wistar大鼠由我校实验动物部提供。RPMI-1640培养基系GIBCO产品。胰蛋白酶系Difco进口分装。异硫氰酸荧光素酯（fluorescence isothiocyanate, FITC）系上海第二军医大学药学系工厂产品。胆固醇酶联试剂盒系上海十八药厂产品。超速离心机系Beckman产品。CO₂培养箱系日本Tabaiespec公司产品。荧光分光光度计系日本Hitachi产品。D-Hanks液（pH7.4）含0.8%NaCl、0.04%KCl、0.006%Na₂HPO₄*H₂O、0.006%KH₂PO₄、0.035%NaHCO₃和0.002%酚红。细胞培养基为含10%小牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640液。

1.2无载脂蛋白E-高密度脂蛋白3的制备与纯化

参照我室方法^［2］。人新鲜血浆经超速离心后，采用吸流法，取密度在1.125～1.210 kg/L部分，经肝素-Sepharose CL-4B亲和层析制备，经电泳证明不含载脂蛋白E。本实验所用HDL₃均为无载脂蛋白E-HDL₃。

1.3大鼠腹腔巨噬细胞制备

以85%普通饲料、2%胆固醇、0.5%胆酸钠和12.5%猪油配成的高脂饲料喂养老鼠，建立高脂模型。实验前4天，大鼠腹腔注射3%无菌硫代乙醇酸钠肉汤，诱导巨噬细胞产生。实验时将大鼠乙醚麻醉处死，用D-Hanks液腹腔灌洗收集腹腔巨噬细胞，1 000 r/min离心10 min，将沉淀用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基制成悬液，调节细胞浓度至3×10⁹个/L，接种于直径35 mm培养皿中。置37℃、5%CO₂孵箱中培养，3 h后洗去未贴壁的细胞，加入2 mL培养基，预培养24 h后加入各种样品。

1.4N-乙酰咪唑修饰高密度脂蛋白3

参照我室方法^［6］。

1.5高密度脂蛋白3的异硫氰酸荧光素酯标记及异硫氰酸荧光素酯-高密度脂蛋白3的纯化

参照我室方法^［7］。

1.6细胞内胆固醇含量的测定

用1 mL 0.5%胰蛋白酶消化贴壁细胞，洗涤，超声波粉碎，离心后取上清液，按胆固醇-酶联法测定胆固醇含量。

1.7N-乙酰咪唑修饰对高密度脂蛋白3介导巨噬细胞内胆固醇流出的影响

实验分三组，每组4皿。分别加入100 μg牛血清白蛋白（BSA）、100 μg HDL₃和100μg N-乙酰咪唑-HDL₃。37℃培养24 h，测定细胞内胆固醇含量。用q检验方法进行数据显著性差异分析。

1.8高密度脂蛋白3和N-乙酰咪唑-高密度脂蛋白3介导细胞内胆固醇外流的时间-效应曲线和剂量-效应曲线

三组各取10皿细胞，分别加入100 μg BSA、100 μg HDL₃、100 μg N-乙酰咪唑-HDL₃。每组再分别分成三组，37℃分别培养12 h（n=3）、24 h（n=4）和36 h（n=3），测定细胞内胆固醇含量，绘制时间－效应曲线。取10皿细胞，分别加入50 μg（n=3）、100 μg（n=4）和150 μg（n=3）HDL₃，相应浓度依次为25、50和75 mg/L。另各取10皿细胞，分别加入相应剂量的BSA和N-乙酰咪唑-HDL₃。37℃培养24 h，测定细胞内胆固醇含量，绘制剂量-效应曲线。

1.9细胞结合、内吞和释放载脂蛋白实验

取6皿细胞，加入100 μg 异硫氰酸荧光素酯-HDL₃，总体积定容至2 mL，37℃培养3 h后用无酚红D-Hanks液洗三遍，分成三组（每组2皿）。第一组每皿加入1.5 mL含0.5％胰蛋白酶的无酚红D-Hanks液，室温消化2 min，回收细胞，超声波粉碎，测定细胞结合内吞的荧光强度（激发波长495 nm，发射波长519 nm）。第二组每皿加1 mL含0.5％胰蛋白酶的无酚红D-Hanks液，0℃处理15 min，离心洗涤后加入1.5 mL含0.5％胰蛋白酶的无酚红D-Hanks液，室温消化2 min，回收细胞，超声波粉碎后加三氯醋酸沉淀蛋白质，分离沉淀和上清液，分别测定细胞内吞三氯醋酸沉淀部分和上清液部分的荧光强度。第三组按第二组0℃处理后再加入2 mL培养基，37℃培养2 h，取上清液加入三氯醋酸沉淀蛋白质，分别测定细胞释放的三氯醋酸沉淀部分和上清液部分的荧光强度。

2结果

2.1N－乙酰咪唑修饰高密度脂蛋白3对其介导巨噬细胞内胆固醇流出的影响

从表1(Table 1)中可见，BSA、HDL₃和N－乙酰咪唑－HDL₃分别介导2.87%、40.68%和8.69%细胞内胆固醇流出，Q检验结果显示HDL₃组与BSA组及N－乙酰咪唑－HDL₃组均有显著性差异(P＜0.05)。而BSA组与N－乙酰咪唑－HDL₃组之间差异不显著（P＞0.05）。

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