［摘要］为观察环孢霉素（syclosporin A）对缺血预处理心脏保护作用的影响，探讨Calcineurin信号通路在心脏缺血预处理中的作用，制备离体大鼠心肌缺血/再灌注模型，测定心功能和心肌Calcineurin活性。结果发现，缺血预处理明显减轻缺血/再灌注的心功能抑制，与单纯缺血/再灌注比较，冠状动脉灌流量、收缩期左室内压最大变化速率和舒张期左室内压最大变化速率分别减少39%（P＜0.05）、33%（P＜0.01）和52%（P＜0.05），心肌钙含量下降21%（P＜0.01）。Calcineurin 抑制剂环孢霉素A可抵消缺血预处理的心肌保护作用。此外，缺血45 min /再灌15 min 使心肌Calcineurin 活性升高，与对照组相比较，Calcineurin活性增加1.9倍（P＜0.01）。单纯缺血预处理组心肌Calcineurin的活性较对照组增加2.3倍（P＜0.01）。环孢霉素A预先处理心脏则完全阻断了缺血预处理诱导的Calcineurin激活，与缺血预处理组相比较，其活性下降75%(P＜0.01)。以上提示Calcineurin途径介导了缺血预处理的心脏保护作用。

［中图分类号］R541.4［文献标识码］A

［文章编号］1007-3949(2000)-02-0103-04

The Role of Calcineurin in Ischemia Preconditioning of Rat Heart

LI Shu-Lian, QI Yong-Fen, CHEN YA-Hong, ZHANG Ying, WANG Xiao-Hong， and TANG Chao-Shu

（Institute of Cardiovascular Disease Research, the First Hospital, Beijing Medical University，Beijing 100034, China)

ABSTRACTAimTo observe the effect of cyclosporin A( a inhibitor of calcineurin).On cardioprotection induced by ischemia preconditioning (IPC) and explore the role of calcineurin (CaN) signal pathway in IPC.MethodsThe model of ischemia /reperfusion (I/R) was produced in isolated rat heart.The cardic functions and the activity of myocardium calcineurin were mersured.ResultsIt was found that IPC apparently attenuated the inhibition of cardic function induced by I/R.Compared with I/R group, in IPC group coronary perfusion flow(CPF),+LVdp/dt max and -LVdp/dt max decreased by 39%(P＜0.01),33%(P＜0.01) and 52%(P＜0.01) respectively.Myocardial calcium content decreased by 21%(P＜0.01).However CsA, the inhibitor of CaN, can conteract the cardioprotection effect of IPC.In addition, the activity of cardiac calcineurin was activated by cardiac I/R, compared with control group, the activity of CaN increased by 1.9 folds; ischemia preconditoning alone activated the activity of cardiac calcineurin and increased by 2.3 folds (P＜0.01) compared with control group.Before ischemia preconditioning administration of CsA completely blocked the activation of calcineurin stimulated by IPC.Compared with IPC group, its activity decreased by 75%(P＜0.01).ConclusionThe results suggest that IPC-induced cardioprotective efffects are mediated by calcineurin pathway.

MeSH Ischemia;Calcineurin;Cyclosporin A;Reperfusion Injury;Rat

预先反复短暂缺血可使心肌在后续的长期缺血中得到保护的现象称为缺血预处理(ischemia preconditioning, IPC)。缺血预处理现象在多种动物及人的心脏都获得证实,但其作用机理尚未完全阐明^［1，2］。大量实验资料提示细胞蛋白激酶C激活及蛋白激酶C介导的蛋白磷酸化增强是预处理细胞保护的共同环节，但蛋白激酶C共同途径学说不能解释预处理细胞保护的全部现象^［2］。现已发现丝裂素活化蛋白激酶系统也介导了IPC的细胞保护作用，并提出IPC现象的细胞内信号转导多途径的观点^［1～3］。Calcineurin(CaN,钙调神经磷酸酶）是一种分布广泛、参与多种细胞功能调节的多功能Ca²⁺依赖蛋白磷酸酶，是Ca²⁺介导的细胞内信号转导途径中的重要因子^［4,5］。本工作在离体大鼠心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）模型上观察CaN阻断剂环孢霉素A（cyclosporin A , CsA）对IPC心脏保护作用的影响，并观察IPC过程中CaN活性的变化，以探讨Ca²⁺-CaN去磷酸化细胞内信号转导途径在心脏缺血预处理中的作用。

1材料和方法

1.1材 料

Wistar 大鼠由北京医科大学实验动物部提供；主要生物化学试剂和三磷酸腺苷测定药盒均购于Sigma 公司。³² P-三磷酸腺苷为NEN DoPont 产品。

1.2离体大鼠心脏灌注模型制备

雄性Wistar 大鼠，体重200±50g，戊巴比妥钠（30mg/kg） 腹腔注射麻醉，股静脉注射1%肝素（0.2mL）抗凝。快速摘取心脏悬挂于Langendorff灌流装置上，以37℃、95%O₂-5%CO₂平衡的Krebs-Henseleit(KH)液经主动脉逆插管以80 mmHg 恒压灌流。

1.3分 组

平衡预灌流15 min后随机分5组（每组6例）。①对照组：大鼠心脏持续灌流120 min；②单纯I/R组：大鼠心脏停灌45 min、再灌注15 min；③IPC组：5 min停灌/5 min再灌重复3次预处理之后，停灌45 min/再灌15 min；④IPC+CsA组：预处理前5 min开始及3次再灌注的KH液中加入CsA，终浓度1.0 μmol/L,然后停灌45 min/再灌流15 min；⑤I/R+CsA组：操作同单纯I/R组，但再灌注的KH液中含CsA 1 μmol/L。

另取一批雄性Wistar 大鼠分4组（n=5）。①对照组：大鼠心脏持续灌流120 min;②I/R组：大鼠心脏停灌45 min/再灌注15 min；③单纯IPC组：5 min停灌/5 min再灌重复3次预处理；④CsA+IPC组：预处理前5 min开始及3次再灌注的KH液中加入CsA，终浓度1.0 μmol/L。

1.4观察指标

1.4.1心功能从左心耳插入球囊导管至左心室，经换能器在生理多导仪上检测收缩期左室内压最大变化速率（+dp/dt max）和舒张期左室内压下降最大速率(-dp/dt max)。

1.4.2心肌损伤指标收集再灌15 min内的全部冠状动脉流出液并记录总量；以自动生物化学分析仪测乳酸脱氢酶活性；考马氏亮蓝法测心肌蛋白漏出量和比色法测肌红蛋白(Mb)漏出量。灌流结束后，留取100 mg心尖组织用试剂药盒测定心肌三磷酸腺苷含量。余下部分心肌组织制备匀浆，离心取上清用硫代巴比妥酸法测定心肌组织脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量，部分心肌经硝酸消化后在原子吸收分光光度计上测定组织钙含量。

1.5心肌组织Calcineurin活性测定^［6］

灌流结束后取心尖部肌肉200 mg,加2 mL匀浆液(mmol/L: 50 Hepes， pH7.4, 28 mercaptoethanol, 0.5 PMSF, 0.1 Leupeptide, 0.1 Na-p-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone, 2 benzamidine)，离心后上清液置于反应缓冲液中(mmol/L: 50 Hepes, pH7.4, 0.6 CaCl₂, 28 mercaptoethanol，50 nmol／L Calmodulin, 3 g/L BSA, 30 nmol/L Calyculin A), 取50 μL含匀浆上清液的反应液加到25 μL ³²Pi标记的反应底物液中，30℃反应30 min，以冷Trichloroacetic acid(TCA) 15 μL终止反应。将反应体系置冰上15 min后离心，取上清45 μL点样于Whatman P81 paper, 干燥15 min后液闪计数，计算CaN 活性,以每分钟mmol ³²Pi/g Pr表示。

1.6³²P标记的底物液制备^［7］

³²P标记的磷酸化组蛋白由 PKA 催化亚基催化组蛋白II-S磷酸化而成。90 mg组蛋白溶于15 mL 50 mmol /L Hepes 缓冲液（10 mmol/L Mg acetate,1 mmol/L DTT）中 。然后，加入0.6 mL 40 mmol/L DTT, 30 μg PKA，5 μmol/L 三磷酸腺苷和30 μCi γ-³² P-三磷酸腺苷到上述组蛋白溶液中，25℃孵育1 h，加TCA终止反应。离心，弃上清，沉淀用 15%的冷TCA洗2次后溶于7.5 mL 0.1 mol/L 的NaOH 溶液中，然后置于 PBS 溶液中透析4 h，换含2.8 mmol/L mercaptoethanol的50 mmol/L Hepes pH7.4缓冲液透析过夜。³²P标记的底物液4℃保存备用。

1.7统计学处理

实验结果以均数±标准差表示,以单因素方差分析和组间q检验进行统计学处理。

2结果

2.1离体灌流心脏冠状动脉灌流量和心功能的变化

与对照组相比较，缺血再灌注（I/R组）使大鼠冠状动脉灌流量降低36%（P＜0.05）,大鼠心脏+dp/dt max及-dp/dt max分别降低58%和72%（P＜0.01）。缺血预处理(IPC组)明显减轻I/R的心功能抑制，其冠状动脉灌流量、+dp/dt max及-dp/dt max分别较单纯I/R组增加67%（P＜0.05）、93%和126%（P＜0.01）。但IPC前给予CaN的抑制剂CsA（CsA+IPC组）可部分抵消IPC的上述作用，与IPC组比较，冠状动脉灌流量、+dp/dt max和- dp/dt max分别下降38%、40%和41%（P＜0.05），其值与单纯I/R组相近(P＞0.0