［摘要］为研究单核细胞源性泡沫细胞凋亡机制，以氧化型低密度脂蛋白诱导人髓系白血病细胞U937凋亡，观察p53、p21和Bcl-2的表 达。用流式细胞术和DNA断裂分析检测细胞凋亡；用细胞免疫荧光标记结合流式细胞术检测p 53、p21和Bcl-2蛋白表达，反转录聚合酶链反应显示p53、p21和 Bcl-2 mRNA表达水平。结果表明氧化型低密度脂蛋白可致U937细 胞凋亡，其作用具有浓度效应；氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞凋亡过程中，p53 、p21 mRNA和蛋白表达增加，Bcl-2 mRNA和蛋白表达减少。提示氧化型 低密度脂蛋白可能通过上调p53、p21基因表达，下调Bcl-2基因, 导致U937细胞凋亡。

［中图分类号］R329.8⁺8［文献标识码］ A

［文章编号］1007-3949(2000)-01-0021-05

Effect of Oxidized Low Density Lipoprotein on Apoptosis and Expression of p53， p21 and Bcl-2 Gene in U937 Cells

YANG Xiang-DongZHANG TongYANG He-PingYANG Yong-Zong

（Institute of Cardiovascular Disease,Hengyang Medical College,Hengyang 421001）

LI JianTIAN Yu-Qian

（Department of Biochemistry,Beijing Institute of Geriatrics,Beijing 100730,China）

ABSTRATEAimTo investigate the mechanism involved in the ap optosis of human myeloid leukemia U937 cells induced by oxidized low density lip oprotein (ox-LDL).MethodsThe apoptotic cel ls were determined by flow cytometry and DNA fragmentation assay.The content o f p53, p21 and Bcl-2 protein were analyzed by immunofluo resence staining and flow cytometric analysis.The level of p53，p21 and Bcl-2 mR NA were quantified by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).Result sOx-LDL induced apoptosis of U937,which is concentration depe ndent,and upregulate the level of p53 and p21 mRNA and protein as detected by RT -PCR and flow cytometric analysis.However,expression of Bcl-2 was downregulated after treatment with ox-LDL.Conclus ionOx-LDL upregulated the gene expression of p53， p21 and dow nregulated Bcl-2 expression, which induced apoptosis of U937 cells.

MeSHOxidized Modification;Lipoprotein, LDL；U937；Apop tosis；Oncogene

泡沫细胞是动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)早期病变的主要病理细胞，由单核细胞/巨 噬细胞或血管平滑肌细胞吞噬并蓄集脂质而形成。As斑块中的泡沫细胞存在凋亡现象，泡沫 细胞的堆积和死亡影响As脂质斑块的稳定^［1］。氧化型低密度脂蛋白（oxidized lo w density lipoprotein, ox-LDL）与As有着密切的关系,它可以通过多条途径促进As的发生 、发展。90年代以来，研究发现氧化应激对细胞凋亡的作用与超氧阴离子的产生和脂质过氧 化有关，与控制细胞凋亡的关键基因p53和Bcl-2也有一定关系^［2～5］ 。我们用氧化型低密度脂蛋白处理人髓系白血病细胞U937，促其向单核细胞分化，发现U937能 吞噬氧化修饰的低密度脂蛋白并蓄集在细胞内，形成泡沫细胞^［6］。本实验以U937细胞为研究对象，以氧化型低密度脂蛋白诱导其凋亡，并观察p53、 p21和Bcl-2基因及其编码蛋白在凋亡过程中的变化，初步探讨其在单核细胞源性泡沫细胞凋亡过程中 的调控作用。

1材料和方法

1.1材料

人髓系白血病细胞U937购自中国科学院上海细胞生物学研究所。RPMI1640培养基、胎牛血清 和Trizol Reagent购自GIBCO公司,Reverse transcription system和PCR core system购自P romega公司。p53、p21、Bcl-2和GAPDH引物由赛百盛公司合成，Bcl-2抗体为兔抗人抗血清，p53和p21抗体为鼠抗人单克隆抗体,二抗为FITC标 记羊抗兔 IgG和FITC标记羊抗鼠IgG，所用抗体均系美国Santa Cruz公司产品。

1.2细胞培养及分组

U937细胞(4×10⁸/L)用含1×10⁵ u/L青霉素、100 mg/L链霉素和10%胎牛血清的RPMI1 640培养基于37℃、5%CO₂条件下培养。对照组不加氧化型低密度脂蛋白,实验组中氧化型 低密度脂蛋白终浓度分别为100 mg/L和200 mg/L,培养48 h。

1.3低密度脂蛋白的分离和氧化

人血浆LDL(d=1.03～1.05)采用超速离心法分离，经琼脂糖电泳 、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫电泳，均显示为单一蛋白带。将LDL置于含10 μmol/L Cu SO₄的PBS (pH 7.2)中, 37℃温育24 h。氧化修饰后的LDL置于含200 μmol/L EDTA的PBS 中透析24 h，超滤除菌后4℃保存。

1.4DNA断裂琼脂糖电泳分析

参照文献［7］提取细胞DNA进行琼脂糖电泳分析。

1.5流式细胞术

1.5.1分析细胞周期亚G1峰收集1×10⁶细胞，用PBS洗2次，用冷冻的70%乙醇4℃过夜固定细胞，离心800 r/min × 5 min, 弃乙醇，500 μL PBS重悬，加Rnase A, 终浓度为50 g/L, 37℃水浴45 min，加入碘 化丙啶（promide iodine, PI）50 g/L，混匀，4℃避光放置60 min，尼龙网滤过，流式细 胞仪（美国BD公司，FACS420）上样检测。

1.5.2p53、 p21和Bcl-2蛋白的表达200 mg/L 氧化型低密度脂蛋白温育U937细胞48 h，收集细胞3×10⁶个，用冷PBS 2 mL洗 涤细胞一次，800 r/min×5 min离心; 4%多聚甲醛2 mL室温固定细胞40 min, 800 r/min×5 min离心; PBS 2 mL重悬细胞，800 r/min×5 min离心；用含0.2% Triton-X100和5%血清的 PBS 1 mL重悬细胞，冰上放置20 min,均分为三份，800 r/min×5 min离心去上清。分别将p 53、p21单抗1∶100稀释，Bcl-2多抗1∶40稀释，饱和剂量加入，冰上放置40 min, 800 r/ min×5 min离心，用冷PBS 2 mL重悬细胞，800 r/min×5 min离心，洗去未结合一抗，重复 一次。加入FITC标记的二抗，冰上避光放置40 min后, 800 r/min×5 min离心，去上清, PB S洗涤两次，加入1%多聚甲醛0.5 mL重悬细胞；流式细胞仪检测，计数10 000个细胞。

1.6反转录聚合酶链反应

应用TRIZOL 提取细胞总RNA,反转录合成cDNA,以GAPDH为内对照，进行半定量反转录聚合酶 链反应。GAPDH引物为：正义链5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTT-3’,反义链5’-CATGTGGGCC ATGAGGTCCACCAC-3’,共983 bp。p53引物为：正义链5’-CTAACCGCGGTCCCTTCCCAGAAAACCT-

AC- 3’, 反义链5’-TACAGTCAGAGCCAACCTCAGGCG-3’,共409 bp。p21引物为：正义链5’-GGAATTCATGTCAG AACCG GCTGG-3’),反义链5’-GCGGA TCCTTAGGGCTTCCTCTTG-3’,共500 bp; Bcl-2引物为：正义链5’-ACTTGTGGCCCAGATAG GCACCCAG-3’,为：正义链5’-CGACTTCG CCGAGATGTCCAG CCAG-3’,共382 bp。 首次循环先在94℃变性5 min, 变性、退火、延伸分别为94 ℃ 1 min， 56℃ 1 min，72℃ 1.5 min, 共30个循环，最后一次循环在72℃延伸10 min;聚 合酶链反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

2结果

2.1细胞周期分析

对照组U937细胞经流式细胞仪检测，细胞凋亡率为1.2%, 用1 00 mg/L 氧化型低密度脂蛋白作用48 h后，凋亡率为7.3%, G2期和S期细胞数减少，G1期细 胞增多, G1期前出现亚G1峰，即凋亡峰,氧化型低密度脂蛋白浓度增至200 mg/L时细胞凋亡 率增至22.2%,峰更加明显(图1， Figure 1)。

图1.氧化型低密度脂蛋白对U937细胞周期的影响

Figure 1．Flow cytometric analysis for apoptosis on U937 cells induced by ox- LDL.

A: control (1.2%)， B: 100 mg/L ox-LDL (7.3%)， C: 200 mg/L ox-LDL (22.2%)

2.2细胞DNA琼脂糖凝胶电泳

分别提取对照组、100 mg/L 氧化型低密度脂蛋白组和200 mg/L 氧化型低密度脂蛋白组细胞 DNA，进行凝胶电泳分析。从图2 (Figure 2)可见100 mg/L 氧化型低密度脂蛋白作用U937 48 h后，DNA电泳出现细胞 凋 亡特有的间隔180～200 bp梯状条带(DNA ladder)，但条带较弱；当氧化型低密度脂蛋白浓 度增至200 mg/L时条带更加明显。

图2.DNA凝胶电泳图谱

Figure2．The apoptosis of U937 induced by ox-LDL were analyzed

by agarose gel electrophoresis.M: PBR322/BstNI MW,1:Control,

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