［摘要］为了研究凝血酶对血管平滑肌细胞血小板源性生长因子基因表达的影响，探讨凝血酶刺激血管平滑肌细胞增殖的机制，通过培养SD大鼠胸 主动脉血管平滑肌细胞 ，以³H-TdR掺入率作为评价凝血酶促血管平滑肌细胞增殖的指标 ；用反转录聚合酶链反应检测凝血酶对血管平滑肌细胞血小板源性生长因子A链mRNA表达的 影响；用Dot blot检测凝血酶对血管平滑肌细胞血小板源性生长因子B链mRNA表达的影响。 结果表明，凝血酶促血管平滑肌细胞增殖呈浓度依赖性和时间依赖性，血管平滑肌细胞在基 础状态下可检测到血小板源性生长因子A和B链mRNA表达，凝血酶刺激血管平滑肌细胞后2 h 血小板源性生长因子A 链mRNA表达开始增加，4～6 h达高峰，持续12 h，24～48 h 恢复正常。提示凝血酶对血管平滑肌细胞具有较强的促增殖作用，凝血酶促血管平滑肌细胞 的增殖作用部分可能是通过诱导血管平滑肌细胞血小板源性生长因子A链mRNA的表达来实现的。

［中图分类号］Q786［文献标识码］A

［文章编号］1007-3949(2000)-01-0026-06

Influence on Platelet-Derived Growth Factor Ligand Gene Expression by Thrombin in Rat Vascular Smooth Muscle Cel1ls

WANG Qi-XianLU Jun-Sheng

（Department of Medicine, the First Affiliated Hospital, Kun ming Medical Colleage, Kunming 650031, China）

ABSTRACTAimTo study the influence of thrombin on gene expression of platelet derived growth factor(PDGF) in cultured vascular smooth muscle cells and probe into the mechanism of proliferation of vascular smooth cells induced by thrombin .MethodsTake the incoporation of ³ H-thymidine as the target to evaluate vascular smooth muscle cells proliferation; thrombin-induced expression of PDGF-A mRNA in the vascular smooth muscle cells was detected by RT-PCR, while PDGF-B mRNA expression by Dot blot hybridization.ResultsThrombin remarkedly stimulated proliferation of SD rat vascular smooth muscle cells in a dose-depedent and a time-dependent manner; PDGF-A and PDGF-B mRNA was detected in quiescent cultured vascular smooth muscle cells in serum-free medium for 48 hours,the expression of PDGF-A mRNA was increased in VSMC after exposure to thrombin for two hours, and reachd a peak levels after 4～6 houres exposure to thrombin.The rising level of PDGF -A mRNA continued for 12 hours,and felt to the base level 24～48 hours afterwards. Conclusion Thrombin remarkedly stimulated proliferation of SD rat vascular smooth muscle cells in a dose-depedent and a time-dependent manner, thrombin-induced vascular smooth muscle cells proliferation was partially mediated by expression of PDGF- A mRNA.

MeSHThrombin;Vascular;Muscle， Smooth；Platelet Derived Growth Factor;Gene Expression；Mice

经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄是以血管损伤部位血栓形成及血管平滑肌细胞（vascular smooth cells, VSMC）增殖为主要病理特征。近来研究表明，凝血酶除有促血凝作用之外 ，还具有许多细胞效应，如激活血小板使其粘附聚集，并释放5-羟色胺、血 栓素A₂、血小 板因子-4、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)和许多凝血物质 ；刺激血管内皮细胞产生血小板源性生长因子、前列环素、内皮素、血小板活化因 子和纤溶酶原激活物；促进VSMC增殖^［1～4］。而在动脉粥样硬化病灶中，内皮细胞 、内膜平滑肌细胞和巨噬细胞的凝血酶受体表达增加^［5］，在球囊导管损伤的动脉 血管壁中，VSMC的凝血酶受体表达也明显上调^［6］，推测凝血酶的增加可能促使VSM C迁移增殖。为进一步探讨其机制，本实验观察了凝血酶对培养的SD大鼠胸主动脉VSMC中PDG F基因表达的影响，旨在从分子生物学水平探讨凝血酶促VSMC增殖的机制。

1材料和方法

1.1材料

实验动物为 SD大鼠；新生牛血清购自杭州四季青公司；DMEM培养基、Trizol、鲑（鲱）鱼精、MMLV反转录酶购自GIBCOL-BRL公司；凝血酶为Sigma产品，来源于牛血清；随机引物标记试剂盒、随机引物、ECORI和dNTPs均为Promega产品;DEPC为Serva产品;去离子甲酰胺为CLONTECH产品;³H-TdR购自上海原子核研究所；α-³² P-dCTP购自北京亚辉生物医学工程公司；其余材料和试剂均为进口分装或国内产品。重组质粒由中科院上海细胞所提供。

1.2血管平滑肌细胞培养

按贴块法进行SD大鼠胸主动脉VSMC原代培养，倒置显微镜下，细胞具有典型的“峰谷”结构。第4～8代细胞用于实验。

1.3重组质粒的制备和cDNA插入片段的回收

采用碱裂解法制备小量质粒DNA^［7］。Pic18-PDGF-BcDNA用ECORI酶切。用上海华顺生物试剂公司柱离心式胶回收试剂盒回收目的cDNA 。

1.4凝血酶对血管平滑肌细胞³H-TdR掺入率的影响

1.4.1细胞处理用含15%小牛血清的DMEM培养液将VSMC数调整至5×10⁷/L,加入24孔细胞培养板，每孔1 mL。48 h后培养板内已有80%的细胞呈汇合状态，吸出培养液，改用含0．4％小牛血清的DMEM培养48 h。

1.4.2不同浓度凝血酶对³ H-TdR掺入率的影响实验组加入含不同浓度凝血酶（ 100 u/L、 500 u/L、 1 000 u/L、 5 000 u/L和10 000 u/L）的培养液，在对照组加入 等体积的含0.4%小牛血清的DMEM培养液。实验组每组为4孔，每孔反应体积为1 mL。加入刺激 因素的同时在培养板内加入³H-TdR 37 kBq/孔,作用24 h后吸出培养液，用磷酸缓冲生理盐水（phosphate buffer solution， PBS）洗孔三次，每孔用1 mL冰冷的10%三氯乙酸于4°C固定细胞30 min，再用10%三氯乙酸洗孔三次。每孔加入0.5 mL 1 mol/L NaOH裂解细胞，显微镜下观察到细胞彻底裂解后，每孔加入0.5 mL 1 mol/L HCl中和，最后每孔取1 mL加入5 mL闪烁液中，用液体闪烁计数仪测cpm值。

1.4.3不同时间凝血酶对³ H-TdR掺入率的影响实验分凝血酶组和对照组，凝血酶组每孔加入每升含凝血酶5 000 u的DMEM培养液（DMEM内含0.4%小牛血清）；对照组加入等体积的含0.4%小牛血清的DMEM。凝血酶组和对照组各4孔，每孔培养液量为1 mL，分别加入凝血酶作用24 h、48 h和72 h，同时每孔加入³H-TdR 37 kBq ,作用不同时间后按前述方法终止³H-TdR掺入实验。

1.5凝血酶对血小板源性生长因子基因表达的影响

1.5.1细胞处理用含15%小牛血清的DMEM培养液将细胞数调整为5×10⁷/L，于100 mL培养瓶中培养，第3～4天生长达汇合状态，然后用含0.4%小牛血清的DMEM培养液培养48 h后，吸出培养液，分为8组，每组两瓶细胞。第一组用凝血酶（5 000 u /L）作用0 h，第2～8组分别作用2 h、 4 h、 6 h、 8 h、 12 h、 24 h和 48 h后提取总RNA。

1.5.2总RNA提取及鉴定用Trizol试剂，按试剂说明书方法提取VSMC的总RNA。取RNA样品4.5 μL,加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液2 μL、甲醛3.5 μL和甲酰胺10 μL,于65°C温育15 min，冰育冷却，离心5 s，使管内所有液体集中于管底，加含EB 0.5 mg/L的甲醛凝胶上样缓冲液2 μL。加样前将凝胶预电泳5 min，电压降为5 V/cm。随后将样品加入凝胶加样孔中，将凝胶浸入1×甲醛凝胶电泳缓冲液中，3～4 V/ cm电压下进行电泳1 h左右，用鹰眼静态成像系统观察并摄片。

1.5.3反转录聚合酶链反应①引物采用文献［8］报导PDGF-A链特引序系列，扩增片段为220 bp, PDGF-A Upstream: 5'-CCT GCC CAT TCG GAG GAA GAG-3', P DGF- A Downstream: 5'-TTG GCC ACC TTG ACG CTG CG-3'; β-actin引物扩增片段为310 bp。 ②PDGF-A链cDNA第一链的合成：样本总RNA (对照组和凝血酶组) 2 μg, 随机引物0.3 μg ,先加DEPC水10 μL，70°C温育50 min，置冰上后按顺序加入：5×buffer 5 μL, dNTP 1 μL, Rnasin 25 u，MMLV 1 μL, 加DEPC水至25 μL, 混匀后置37°C 90 min 95°C灭活反转 录酶10 min。 ③PCR: 反转录产物（cDNA） 2.5 μL, dNTP 1 μL (10 mm)，10×buffer 5 μL, MgCl₂ 5 μL, PDGF-A上游引物：2 μL (10 pmol),下游引物2 μL (10 pmol)，β-act in上游引物1 μL (10 pmol),下游引物1 μL (10 pmol)。Taq DNA Polymerase 0.5 μL (5×10⁶ u/L ),加灭菌去离子水至50 μL, 混匀后加液体石蜡50 μL，短暂离心15 s。PCR扩增首轮循环：94°C 5 min，58°C 35 s，72°C 1 min；后续循环：94°C 1 min，58°C 35 s，72°C 1 min；末轮循环：94°C 1 min，58°C 35 s，72°C 10 min；共25～