关键词： 细胞粘附；心肌缺血；再灌注损伤

摘要：目的探讨细胞间粘附分子(ICAM-1)表达与中性粒细胞(PMNs)浸润与心肌缺血再灌注损伤(IRI)的关系并观察N-乙酰半胱氨酸(NAC)对IRI的保护效果。方法大鼠116只，分设：(1)缺血再灌注(IR)组；(2)IR+NAC组；(3)假手术对照组，并分设再灌注1、3、6、12、24 h时相点。取缺血心肌用原位杂交和免疫组织化学检测ICAM-1 mRNA及其蛋白表达水平，用酶法测定PMNs浸润数，TTC染色法测心肌梗死范围。结果心肌再灌注时，ICAM-1表达明显增高，其mRNA表达至6 h达高峰，而蛋白质表达水平、PMNs浸润数和梗死范围改变于12～24 h达高峰，三者间呈显著正相关，但ICAM-1 mRNA与后三者间无明显相关性。IR+NAC组上述指标于再灌注时虽也明显增高，但比IR组明显减轻，除ICAM-1蛋白质表达于再灌注3 h前无显著变化外，其余P均＜0.05或0.01。结论心肌IR时，ICAM-1参与介导了PMNs对组织细胞的粘附、浸润和IRI的发生、发展；NAC可通过抑制ICAM-1的表达而产生心肌保护作用。

Influence of expression of intercellular adhesion molecule-1 on myocardial ischemic reperfusion injury and cardiac protective effect of N-acetylcysteine

CHEN YunzhenHE Guoxiang, et al.

（Department of Cardiology, First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China）

SI Liangyi

（Southwest Hospital, Chongqing 400038, China）

Abstract：ObjectiveTo investigate the influence of expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) on myocardial ischemic reperfusion injury (IRI), myocardial infiltration of polymorphonuclear neutrophils(PMNs) and infarction size, and the cardiac protective effect of N-acetylcysteine(NAC).MethodsOne hundred and sixteen rats were divided into three groups: IR, IR+NAC and sham-group. The ischemic myocardial samples were studied at 1,3, 6,12, 24 hours after ischemic reperfusion (IR). The levels of expression of ICAM-1 mRNA were evaluated by in situ hybridization and the protein by immunocytochemistry. The numbers of infiltrated PMNs were measured with MPO enzyme marker method and the myocardial infarction area was evaluated by TTC staining method.ResultsAfter IR, myocardial levels of expression of ICAM-1 mRNA were increased significantly and reached a peak at 6 h; but the ICAM-1 protein peaked during 12-24 h. Number of PMNs and infarction size also increased and peaked after reperfusion 12-24 h. Close positive correlation (P＜0.05) was found between the levels of expression of ICAM-1 protein, PMNs infarction area of the myocardium. In IR+NAC group, all of the indices were increased after IR, but the levels of increase in IR+NAC group were significantly lower (P＜0.05 or 0.01) as compared with group IR (P＜0.05-0.01).ConclusionThe findings indicate that PMNs adhesion and infiltration induced by ICAM-1 is implicated in the development of myocardial IRI. NAC could protect the myocardium from IRI by partially blocking the expression of ICAM-1.

Key words：Cell adhesion;Myocardial ischemia;Reperfusion injury

心肌缺血再灌注(ischemic reperfusion, IR)时，中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils, PMNs)对缺血心肌的浸润可引起并加剧心肌细胞的损伤，导致细胞死亡已被证实^［1］。但PNMs的触发激活机制仍未彻底阐明；近年的研究发现细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)在介导PMNs参与的缺血再灌注损伤中起到了重要作用^［2］。本实验应用大鼠心肌缺血再灌注损伤(ischemic reperfusion injury, IRI)模型，观察心肌缺血再灌注时ICAM-1 mRNA及其蛋白质表达规律及与PMNs浸润和IRI的关系，从分子水平探讨心肌IRI的发生机制并观察N-乙酰半脱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)对IRI的保护效果。

材料与方法

一、主要试剂

鼠ICAM-1 cDNA质粒(美国加州西北大学分子及细胞生物学系Mayo博士馈赠)，限制性内切酶EcoRI、限制性内切酶Kpn I(德国宝灵曼公司)，ICAM-1单克隆抗体(美国R & D公司)，SP免疫组织化学测试药盒(福州迈新公司)，HTAB，O-dianisidine, TTC, NAC(Sigma公司)，其余试剂均为分极纯级。

二、动物模型制作及实验分组

Wistar大鼠116只，体重250～300克，雌雄不拘，随机分设缺血再灌注组(IR组)，IR+NAC治疗组和假手术对照组：IR组和IR+NAC组均先缺血1 h，然后设再灌注1、3、6、12、24 h共5个时相点：对照组只设12 h一个时相点作总体对照。每组各6只大鼠，心肌缺血再灌注损伤模型参照方喜业^［3］方法加以改进，以收紧结扎线后心电图I导联或左前胸导联融合的ST-T抬高，结扎线放松后抬高的ST-T下降1/2以上为模型成功。治疗组于缺血10 min腹腔注射NAC 160mg/kg。对照组只埋线不结扎。于各相应时相点杀死动物取心脏将缺血区心肌分为A、B两片待测。另用50只大鼠按以上分组，每组5只，测定心肌梗死范围。

三、指标检测

1.ICAM-1 mRNA原位杂交：参照蔡文琴等^［4］方法，制备感受态JM109大肠杆菌，将质粒转入大肠杆菌进行扩增；裂解细菌后离心，分离纯化质粒DNA，再用EcoR I和Kpn I两种限制性内切酶双切质粒cDNA，经电泳分离和透析得到高纯度的cDNA探针片段。用地高辛随机引物法标记cDNA探针。心肌作冰冻切片行原位杂交24 h(45℃孵育)；加抗地高辛抗体后NBT/BICP显色，封片。结果用CMIAS007计算机医学图像分析仪处理，单位以面密度(目标总面积/统计场总面积)表示。

2.ICAM-1蛋白质表达水平测定^［4］：取待测心肌冰冻切片用SP免疫组织化学染色法进行，DAB显色：结果用CMIAS007计算机医学图像分析仪处理，单位以面密度表示。

3.心肌中性粒细胞浸润数测定：参照Bradley等建立的髓过氧化物酶(MPO)法测定心肌中的中性粒细胞浸润数量^［5］。

4.心肌梗死范围测定^［6］：用TTC染色法进行，以梗死心肌与左室重量的百分比表示梗死范围。数据资料以±s表示，采用Origin统计软件中的单因素方差分析，直线拟合程序处理数据，以P＜0.05差异有显著性，P＜0.01差异有非常显著性。

结果

一、缺血再灌注时心肌ICAM-1 mRNA表达规律及NAC对表达的影响

IR组和IR+NAC组于心肌缺血再灌注1 h ICAM-1 mRNA表达均明显增加，再灌注6 h达高峰，以后逐渐下降，至24 h仍维持较高的表达水平。与对照组比较，P均＜0.05～0.01；虽然IR+NAC组的ICAM-1 mRNA表达于缺血再灌注时有显著的增加，但程度较IR组明显轻，P均＜0.05～0.01(图1)。

图1心肌再灌注(IR)时NAC对ICAM-1 mRNA表达的影响

二、缺血再灌注时心肌ICAM-1蛋白表达变化规律及NAC的影响

两实验组于缺血再灌注后ICAM-1蛋白质的表达均呈进行性增加，再灌注3 h后其表达速度明显加快，于再灌注12 h后又有所减慢，至24 h仍未见有下降趋势。IR+NAC组于再灌注3 h后与IR组比较，其增加的程度显著减低，P＜0.01(图2)。

图2再灌注时NAC对ICAM-1蛋白质表达的影响

三、缺血再灌注心肌中性粒细胞浸润数变化规律及NAC的影响

心肌缺血再灌注1 h，IR组中性粒细胞浸润数量即已明显增加，以后呈进行性增高，再灌注12 h达峰值，至24 h仍无下降趋势。IR+NAC组的变化规律类似IR组，但程度则明显低于IR组，两组间各时相点比较，P均＜0.01。

四、NAC对缺血再灌注心肌梗死范围的影响

随着心肌缺血再灌注时间的推移，IR组和IR+NAC组的梗死范围均呈进行性增加，IR+NAC组于灌注3～6 h后梗死范围的增加得到明显抑制，而单纯IR组则于12 h后梗死范围的扩展速度才有所减缓；各相应时相点两组间比较，心肌梗死范围IR+NAC组明显较IR组缩小，P＜0.01(图3)。

图3缺血再灌注时NAC对心肌梗死范围的影响

五、各指标间的相关分析