关键词： 血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂；心肌；细胞；膜片钳术；离子通道

摘要：目的研究血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（AngⅡ-Antipeptide）对单个豚鼠心室肌细胞膜上L型钙通道电流（I_Ca-L）、ATP敏感钾通道电流（I_K-ATP）延迟整流钾通道电流（I_K）、瞬间内向电流（I_ti）及内向整流钾通道电流（I_K1）的影响。方法应用膜片钳全细胞记录方法。结果（1）AngⅡ-Antipeptide (5 μmol/L)抑制I_Ca-L，但并不改变I-V曲线形态，（2）AngⅡ-Antipeptide (5 μmol/L)抑制I_K-ATP，（3）AngⅡ-Antipeptide (5 μmol/L)对I_K及I_K._tail均有抑制作用，（4）AngⅡ-Antipeptide (5 μmol/L)在低钾、高钙溶液中，抑制I_ti电流，并明显延长滞后时间（lag-time），（5）AngⅡ-Antipeptide对内向整流钾通道电流（I_k1）无明显作用。结论AngⅡ-Antipeptide对上述通道选择性不高，但推测它对以上通道综合影响在保护心肌及抗心律失常方面具有协同作用。

Effects of angiontensin II antipeptide on ion channels in guinea pig ventricular myocytes

ZHAO YingHU DayiYANG Xinchun, et al.

（Heart Center, Beijing Red Cross Chaoyang Hospital, Beijing 100020, China）

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of angiontensin II receptor antipeptide (AngII-antipeptide) on I_K（ATP）, I_Ca-L, I_K and I_ti of guinea pig ventricular myocytes.MethodWhole cell patch clamp technique was used.Results(1) I_Ca-L was inhibited by AngII-antipeptide (5 μmol/L) (from -0.75±0.16 to -0.42±0.09 nA, n=10,P＜0.05), but the shape of I-V curve was not changed. (2) I_K(ATP) was inhibited by AngII-antipeptide (5 μmol/L) (1.52±0.24 to 0.94±0.13 nA, n=10, P＜0.05). (3) Both I_K and I_K._tail were inhibited by AngII-antipeptide (5 μmol/L) (0.96±0.10 and 0.45±0.08 nA to 0.40±0.06 and 0.18±0.06 nA, n=8, P＜0.05, respectively). (4) In low K⁺ high Ca²⁺ solution, I_ti was inhibited by AngII-antipeptide (5 μmol/L) (-0.41±0.11 to -0.19±0.06 nA, n=9, P＜0.05), and I_ti lag time was significantly prolonged from 165±23 to 204±25 ms (n=9, P＜0.05). (5) AngII-antipeptide (5 μmol/L) had no effects on I_K1.ConclusionAngII-antipeptide might protect the ischemic cardiomyocytes and prevent arrhythmia.

Key words：Angiotensin Ⅱ antipeptide；Myocardium;Cells;Patch-clamp techniques;Ion channels

有研究报道，血管紧张素Ⅱ对心肌细胞的电生理作用是通过受体影响离子通道活性而实现的^［1］，AngⅡ-Antipeptide是一种非选择性肽类血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂。本研究采用膜片钳全细胞记录方法观察它对L型钙通道电流（I_Ca-L）、ATP敏感钾通道电流（I_K-ATP）、延迟整流钾通道电流（I_K）、瞬间内向电流（I_ti）的影响及对内向整流钾通道电流（I_K1）的影响，探讨AngⅡ-Antipeptide (5 μmol/L)对心肌细胞电生理作用的机制。

材料与方法

1．细胞分离：本研究以单个豚鼠心室肌细胞为研究对象，采用经典的酶解分离方法^［2］。

2．膜片钳全细胞记录：将细胞悬浮液滴于倒置显微镜工作台的细胞池内，待细胞沉淀3分钟后，以细胞外液灌流，流速为1～2 ml/min，所用液体经95％O₂＋5％CO₂混合气体饱和，并恒温至37°C。电极阻抗为3～5 MΩ，充以电极内液。电流信号经由EPC-9膜片钳放大器（HEKA Electronic，德国）放大，滤波后储存于计算机（Macintosh, Quadra，650德国）硬盘，脉冲信号的控制、数据的采样及分析均由Pulse＋Pulsefit 7.89软件（HEKA Electronic，德国）完成。

3．液体组成（单位均为mmol/L）：（1）正常台氏液：NaCl 137, KCl 5.4, MgCl₂ 1.05, NaHCO₃ 11.9, NaH₂PO₃ 0.42, Glucose 5.5, CaCl₂ 1.8（用NaOH调pH至7.35）；（2）无钙液: NaCl 116, KCl 5.4, NaH₂PO₄ 1.4, NaHCO₃ 15, MgSO₄ 1, Glucose 15（用NaOH调pH至7.35）；（3）记录I_Ca-L的电极内液：CsCl 80, CsOH 40, MgCl₂ 2, EGTA 10, HEPES 10（用CsOH调pH至7.4）；（4）记录I_K-ATP的电极内液：KCl 140, EGTA 0.05, HEPES 5（用KOH调pH至7.4）；（5）记录I_K的电极内液：KCl 140, HEPES 5, EGTA 10, Na₂-ATP 2.0, MgCl₂ 1.0（用KOH调pH至7.3）；（6）记录I_ti的电极内液：KCl 110, Na₂-ATP 5, HEPES 10, MgCl₂ 5.85, EGTA 0.5, CaCl₂ 0.02（用KOH调pH至7.3）；（7）记录I_K时用含CdCl₂的灌流液: NaCl 137, KCl 5.4, CaCl₂ 1.8, NaH₂PO₄ 0.16, NaHCO₃ 3.0, Glucose 10, HEPES 5.0, CdCl₂ 0.1（用KOH调pH至7.4）；（8）诱发I_ti时的低钾高钙液：NaCl 116，KCl 0.54， NaH₂PO₄ 1.4，NaHCO₃ 15，MgSO₄ 1，CaCl₂ 5.4，Glucose 15（用NaOH调pH至7.4）。

4．数据处理：实验数据以均数±标准差（±s）表示，差异采用自身对照t检验。

5．药剂及试剂：蛋白酶E、EGTA、HEPES及AngⅡ Antipeptide 为Sigma公司产品， AngⅡ Antipeptide分子量899，非选择性肽类血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，其余试剂均为国产分析纯。

结果

1． AngⅡ-Antipeptide对I_Ca-L影响：钳制电压-40 mV～+60 mV、阶跃为10 mV，脉冲保持时间200 ms，诱发出I_Ca-L后，以Ang Ⅱ-Antipeptide（5 μmol/L）灌流10分钟，以去极化至0 mV时I_Ca-L最大值为观察指标。结果表明，I_Ca-L由用药前的（-0.75±0.16）nA降至（-0.42±0.09） nA（n=10,P＜0.05），但并未改变I-V曲线形态，最大激活电位均在0 mV，用空白灌流液冲洗10分钟后，I_Ca-L基本恢复至用药前水平（图1）。

图1AngⅡ-Antipeptide对I_Ca-L抑制作用的电流曲线

2． AngⅡ-Antipeptide对I_K-ATP的影响：钳制电压-100 mV～+60 mV、阶跃为10 mV，脉冲保持时间500 ms，用含代谢抑制剂2，4-DNP（2, 4-Dinitrophenol）的灌流液灌流，使心肌细胞代谢受阻，细胞内ATP大量分解且合成减少，产生类似缺血、缺氧条件下的病理生理改变，使ATP敏感钾通道开放，连续观察I_K-ATP电流曲线的形态变化，当电流曲线由“N”形变成直线时，表明I_K-ATP通道完全开放（图2），即刻在上述灌流液中加入AngⅡ-Antipeptide（5 μmol/L），作用10分钟，以去极化至0mV时的I_K-ATP最大值为观察指标。结果发现，I_K-ATP由用药前的（1.52±0.24） nA降至（0.94±0.13） nA （n=10, P＜0.05），如图3所示。

图2I_K-ATP通道在失活与完全激活状态下时的电流曲线

图3AngⅡ-Antipeptide对I_K-ATP抑制作用的电流曲线

3．AngⅡ-Antipeptide对I_K和I_K.tail影响：为了阻断Ca²⁺通道，以含CdCl₂的细胞外液灌流，钳制电压-40 mV～+60 mV、阶跃为10 mV，脉冲保持时间5 s，诱发出I_K和I_K.tail，以去极化至+60 mV时的I_K峰值为观察指标。AngⅡ-Antipeptide（5 μmol/L）作用10分钟后，I_K和I_K.tail分别由用药前的（0.96±0.1） nA、（0.45±0.08） nA降至（0.40±0.06） nA及（0.18±0.06） nA（n=8,P＜0.05），如图4所示。

图4AngⅡ-Antipeptide对I_K和I_K.tail抑制作用的电流曲线

4.AngⅡ-Antipeptide对I_ti