关键词： 反义寡核苷酸；C-sis原癌基因；内膜增生；局部干预

摘要：目的研究主动脉球囊损伤后，C-sis原癌基因反义寡核苷酸(AODN)局部干预对血管内膜增生的影响。方法36只新西兰白兔随机分为C-sis原癌基因AODN组、正义寡核苷酸(SODN)组及生理盐水组，每组12只。球囊损伤胸主动脉后，1 mg AODN、SODN用于损伤局部干预，高胆固醇饲养， 用RT-PCR技术及组织学方法结合图像分析，观察AODN对损伤血管C-sis表达及内膜增生的影响。结果AODN明显抑制损伤血管C-sis表达，SODN无抑制作用；AODN组、SODN组及生理盐水组，内膜增生厚度分别为(8.54±1.59) μm、(24.59±2.14) μm、(25.15±2.31) μm，AODN组平均抑制(65.7±9.6)%的内膜增生。结论C-sis原癌基因AODN局部干预明显抑制球囊损伤血管内膜增生，其抑制作用与抑制损伤血管C-sis原癌基因表达密切关联。

Local delivery of C-sis proto-oncogene antisense oligodeoxynucleotides inhibits intimal hyperplasia in rabbit injured aorta

TANG QidongLIN ShuguangWANG Ruojie.

（Guangdong Cardiovascular Institute, Guangzhou 510080, China）

Abstract：ObjectiveTo study the inhibitory effect of locally delivered C-sis proto-oncogene antisense oligodeoxynucleotides (AODN) via balloon catheter on intimal injury following balloon angioplasty in rabbit aorta.MethodsThirty six rabbits were divided into AODN and sense oligodeoxynucleotides (SODN) treated groups and control group randomly (n=12, each). Each of the rabbits was injured with channeled balloon catheter 1 mg of C-sis proto-oncogene AODN or SODN was locally delivered on injured aorta with inflated balloon at 0.5×10³ kPa for 8 minutes. The rabbits were fed with 2.0% cholesterol diet for 3 days or 28 days. Expression of C-sis proto-oncogene was determined by using of RT- PCR. Morphological analysis of intimal hyperplasia was performed with histologic staining and image analyzer.ResultAODN inhibited C-sis proto-onconge expression in injured aorta obviously. SODN showed no effect on c- sis mRNA. Thickness of intimal hyperplasia following locally delivered AODN, SODN and 0.9% NaCI solution on injured aorta was 8.54±1.59, 24.59±2.14 and 25.15±2.31 μm, respectively. Inhibitory rate of intimal hyperplasia with locally delivered AODN was (65.7±9.6)%.Conclusion Local delivery of C-sis proto-oncongene AODN following balloon angioplasty on injured aorta inhibits intimal hyperplasia, and the inhibitory effect was associated with suppression of c- sis proto-oncongene expression on the injured aorta.

Key words：Antisense oligodeoxynucleotide;C-sis proto-oncogene;Intimal hyperplasia;Local delivery

迄今为止，传统药物治疗都未能降低经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)术后再狭窄的发生率^［1,2］。随着分子生物学的发展，反义寡核苷酸基因封闭技术作为一种全新的基因表达调控技术，已受到高度重视，对于再狭窄中癌基因的过度表达，可以用此技术进行特异性的基因封闭治疗，达到预防再狭窄的目的^［3,4］；随着研究的深入，发现血管平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）迁移和增殖是再狭窄发生的关键因素之一；而近年的研究说明，PTCA损伤导致的SMC迁移和增殖与C-sis原癌基因的过度表达紧密关联，动脉内膜损伤后，C-sis原癌基因表达是正常的5倍^［5］；而C-sis原癌基因是血小板衍化生长因子B(platelet-derived growth factor-B, PDGF-B)的结构基因，其表达的PDGF-B蛋白是SMC迁移和增殖的强烈促进因子^［5］。因而，通过分子水平的设计来特异性地调控C-sis原癌基因表达PDGF-B的水平，达到抑制SMC的迁移和增殖，为有效地预防PTCA术后再狭窄的发生，探索一种反义寡核苷酸的基因治疗途径。

材料与方法

1.C-sis原癌基因寡核苷酸合成：以人C-sis癌基因翻译起始区域18个碱基序列为模板，用DNA合成仪，合成C-sis原癌基因反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleiotide, AODN)、正义寡核苷酸(sense oligo-deoxynucleiotide, SODN），在合成过程中以硫取代碘进行氧化，对碱基进行硫代磷酸化修饰，提高AODN、SODN的血清稳定性^［4］。AODN序列如下：3′TACTTAGCGACGACCCGC5′，SODN系列为：3′GCG GGTCGTCGCTAAGTA5′。寡核苷酸真空冷冻干燥后溶解于生理盐水中，用紫外分光光度仪进行浓度测定。

2.动物胸主动脉球囊损伤、C-sis原癌基因反义寡核苷酸局部干预：新西兰白兔38只，雄性(2.5±0.1) kg来自中山医科大学动物中心。动物随机分为AODN、SODN及生理盐水对照三组，每组12只动物，2只用于检测正常动脉壁C-sis原癌基因表达；相应组每只动物分别给予AODN 1 mg、SODN 1 mg(体积2 ml)及生理盐水2 ml。氯胺酮静脉麻醉，导丝引导，从股浅动脉插入3F球囊导管20 cm，抽出导丝，加压10³ kPa(1 kPa=7.5 mm Hg)，扩张30 s，排空球囊内压力30 s，如此扩张三次，完成损伤；然后，排空压力，球囊后退3 cm，再加压506.6 kPa，从导管侧孔分别给予三种处理，维持0.5×10³ kPa并阻断血流8 min，排空大气压，退出导管，结扎股浅动脉；术后注射青霉素钠3天。饲以2%胆固醇+2%猪油+2%玉米油的普通兔饲料，3天后，每组处死2只动物，余下动物28天后全处死；分离胸主动脉至股动脉，从结扎的股浅动脉量至近心端20 cm处，向远心端取胸主动脉2 cm(相当于球囊长度)，进行各种检测。术前及处死动物时，分别检测血总胆固醇浓度。

3.组织学检测损伤局部内膜增生改变：2 cm胸主动脉，每间隔0.25 cm长度，取材0.25 cm组织，每兔共取材4块，10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，切片厚4 μm，每间隔5张切片(20 μm)取一张切片，每组织块取切片9张，每兔共取切片36张，HE染色，用图像分析仪分析内膜增生平均厚度，计算内膜增生抑制百分率=（1-寡核苷酸处理组内膜增生厚度/对照组内膜增生厚度）×100%。取损伤后3天的胸主动脉, 用S-P免疫组化试剂盒, 按照Shi等^［6］的方法进行PDGF-B的免疫组化染色。

4.逆转录PCR(RT-PCR)检测C-sis原癌基因表达：用RNA抽提试剂盒(pharmacia)对100mg胸主动脉组织进行总RNA抽提，经逆转录试剂盒(boehringer mannheim)合成cDNA，用DNA扩增仪，按照Boehringer mannheim提供的程序进行cDNA的PCR扩增；扩增引物如下：C-sis引物5′CCCAGCCCC CCACCCTGGC 3′，5′GGGCAATACAGC AAATACCA 3′；β-actin引物5′AAGGATTCCTAT GTGGGC 3′，5′CATCTC TTGCTCGAAGTC 3′；β-actin扩增30个循环，C-sis扩增36个循环。扩增产物于含溴化乙啶的2%琼脂糖中电泳，Bio-Rad 1000凝胶成像密度仪分析扩增结果。

5、统计学分析：所有资料用均数±标准差表示，用ANOVA的t检验进行统计学差异分析，以P＜0.05作为差异有显著性。

结果

1.喂养前后血胆固醇浓度变化：胆固醇喂养28天前及后，AODN组、SODN组及生理盐水组白兔血胆固醇浓度分别为(1.66±0.42) mmol/L、(1.63±0.43) mmol/L和(1.61±0.53) mmol/L, 及喂养后为(34.74±8.98) mmol/L、(36.12±10.65) mmol/L和(34.62±9.39) mmol/L；喂养前后同组比较，每组P＜0.01，而组间比较，均显示P＞0.05。表明喂养后血胆固醇浓度显著高于喂养前，而不同处理组间的血胆固醇浓度较一致。

2.C-sis原癌基因AODN抑制球囊损伤胸主动脉内膜增生：损伤28天胸主动脉，比较AODN、SODN组，其内膜增生明显变薄；观测内膜面到内弹性膜的平均厚度，AODN、SODN及生理盐水组分别是(8.54±1.59) μm、(24.59±2.14) μm、(25.15±2.31) μm。与对照组比较，AODN组差异有极显著性(P＜0.001)；而SODN组差异无显著性（P＞0.05）；C-sis原癌基因AODN对内膜增生抑制百分率平均为（65.7±9.6）%, 而SODN对内膜增生无抑制作用。

3.AODN对PDGF-B的免疫组化染色的影响：球囊损伤3天后，胸主动脉免疫组化染色，AODN处理未见免疫着色，而SODN组及生理盐水组，均见明显的免疫着色反应，表明AODN强烈抑制PDGF-B的产生，而SODN及生理盐水不影响PDGF-B合成。

4.AODN对C-sis原癌基因表达的影响：RT-PCR扩增后，正常胸主动脉壁未见C-sis原癌基因表达，损伤3天后，SODN及对照组C-sis原癌基因表达明显增高，电泳为单一条带，与预测867bp相一致；而AODN组未见C-sis原癌基因表达；损伤后28天，AODN、SODN及生理盐水三组处理均未见C-sis原癌基因表达；β-actin基因扩增后，可见532 bp的单一条带。

讨论

反义寡核苷酸用于再狭窄的基因治疗，已受到高度重视，但全身给药消耗量大，费用高，效果难以保证。我们将小剂量C-sis原癌基因AODN用于兔主动脉球囊损伤处局部干预，对于损伤后血管狭窄的发生，获得了抑制（65.7±9.6）%内膜增生的良好预防效果。

动脉球囊损伤后，导管后退3 cm，加压0.5×10^3<