关键词： 高血压；心肌；细胞

【摘要】目的探讨心肌细胞凋亡在自发性高血压大鼠(SHR)心脏重塑中的作用及其意义。方法采用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)和透射电子显微镜技术,观察不同年龄SHR心肌细胞凋亡的变化及其规律。结果(1)1月龄SHR组［无左室肥厚组(NLVH组)］和18～20月龄SHR组［充血性心力衰竭组(CHF组)］凋亡的心肌细胞核数目和凋亡指数显著增加（P均＜0.01)，10月龄SHR组［左室肥厚组(LVH组)］则显著减少(P均＜0.01)。(2)有LVH的SHR中,心肌细胞凋亡与LVH呈显著负相关(P＜0.01)。(3)透射电子显微镜检查发现NLVH组和CHF组SHR左心室心肌组织中可见具有凋亡形态学特征的凋亡心肌细胞(胞质浓缩、胞核染色质浓聚边集)，LVH组和CHF组可见心肌细胞肥大、肌浆网扩张和线粒体增生等改变。结论(1)SHR LVH发生前和出现CHF后其心肌细胞凋亡显著增加；SHR伴显著LVH时其心肌细胞凋亡显著减少。提示心肌细胞凋亡在SHR心脏重塑中起重要作用，心肌细胞凋亡减少可能与LVH有关，而心肌细胞凋亡增多可能与CHF有关。(2)在SHR高血压→LVH→心力衰竭演进过程中存在心肌细胞凋亡的动态变化，可根据这一过程中心肌细胞凋亡的时间窗选用刺激或抑制心肌细胞凋亡的策略来改善高血压心脏重塑。

Changes and significance of cardiac myocyte apoptosis in spontaneously hypertensive rat

LI Faqi, CHEN Yunzhen. Department of Cardiology, First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016

【Abstract】ObjectiveTo study the effects and significance of cardiomyocyte apoptosis participating in the cardiac remodeling of spontaneously hypertensive rats (SHR). MethodsWe investigated the dynamic changes of cardiac myocyte apoptosis in left ventricle of SHR and Wistar-Kyoto rats (WKY) using in situ TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) and transmission electron microscope.Results(1)Apoptotic myocyte nuclei and apoptotic index (calculated by dividing the number of apoptotic myocyte nuclei by the total number of myocyte nuclei and multiplying that value by 100) were higher in 1-month-old SHR group ［no left ventricular hypertrophy (NLVH) group］ and 18-20-month-old SHR group ［congestive heart failure (CHF) group］ than those in age -matched WKY group respectively (all P values less than 0.01). Apoptotic myocyte nuclei and apoptotic index were lower in 10-month-old SHR ［left ventricular hypertrophy (LVH) group］ than those in age-matched WKY group, NLVH group and CHF group (all P values less than 0.01). (2) Apoptotic index was inversely correlated with left ventricular hypertrophic index in SHR with LVH and CHF (n=6, r=-0.90, P＜0.01, y=3.24-0.09x; n=5, r=-0.87, P＜0.01, y=4.76-0.02x). (3) Electron microscopic features of cardiocyte apoptosis (including intact sarcolemma in the presence of cytoplasm compaction and segregation of nuclear chromatin into small sharply delineated electron dense masses that abut the nuclear envelope) were identified in left ventricular tissue obtained from SHR with NLVH group and CHF group but in none of the tissue specimens obtained from the left ventricles of the others. The ultramicrostructural changes, such as cardiac cellular hypertrophy, sarcoplasmic reticulum expansion, mitochondrion hyperplasia, occurred in left ventricular tissue obtained from SHR with LVH group and CHF group.Conclusion(1) Cardiac myocyte apoptosis increases significantly in the left ventricle of SHR with CHF and without LVH. However, cardiomyocyte apoptosis decreases markedly in the left ventricle of SHR with LVH. These findings suggest that cardiac myocyte apoptosis may play a key role in the heart remodeling of SHR, and that cardiomyocyte apoptosis decreasing may be bound up with LVH and cardiac myocyte apoptosis increasing may be related with CHF of SHR. (2) The dynamic changes of cardiac cell apoptosis occur in the hypertension→LVH→heart failure volving process. It is possible that the heart remodeling is ameliorated by the therapeutic strategies of stimulating or suppressing cardiomycoyte apoptosis according to the time window of cardiac cell apoptosis in the above process.

【Key words】hypertensionmyocardiumcells

细胞凋亡,又称程序性细胞死亡，是一种与细胞坏死截然不同的由基因调控的主动性非炎症性细胞死亡形式，在许多疾病的发生发展中起重要作用。目前心血管疾病细胞凋亡的研究主要集中在冠心病、心律失常、心肌炎及心肌病方面^［1］，至于细胞凋亡与高血压病及其靶器官损害的研究尚少报道。本研究采用自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)为实验模型，观察不同年龄SHR左室肥厚(LVH)前、LVH时和心力衰竭后心肌细胞凋亡的变化情况，揭示心肌细胞凋亡在SHR LVH和心力衰竭发病中的作用、规律及其意义。

材料与方法

1.实验动物:SHR购自中国医学科学院心血管病研究所实验动物中心；正常Wistar大鼠(Wistar-Kyoto rats, WKY)购自重庆医科大学实验动物中心。

2.实验动物分组:(1) 1月龄SHR组(6只，雄性、雌性各3只)， 体重47.4～52.4 g，无LVH组(NLVH组)。(2) 10月龄SHR组(6只，雄性、雌性各3只)，体重206.7～340.0 g，有明显LVH组(LVH组)。(3) 18～20月龄SHR组(5只，雄性3只，雌性2只)，体重352.8～389.3 g，有显著LVH伴心动过速，呼吸急促，腹腔积液，胸膜心包积液，心房血栓和右室肥厚等充血性心力衰竭(CHF)表现(CHF组)。按年龄和性别配对分别配以WKY组。

3.心肌肥厚指数计算:取上述各组大鼠，腹腔内注射10％水合氯醛(0.4 ml/100 g)麻醉，直接开胸切取心脏，去除心房，大血管和心包组织(同时注意观察胸腔积液，心包积液和心房血栓)，沿室间隔分离左心室(包括室间隔)和右心室，冰冷生理盐水冲洗干净，清洁滤纸吸干水份后称左心室(含室间隔)湿重和右心室湿重,计算左心室湿重/体重(LVW/BW，mg/g)和右心室湿重/体重(RVW/BW，mg/g),即为左心室心肌肥厚指数和右心室心肌肥厚指数。

4.心肌细胞原位末端标记与半定量分析:取左心室游离壁中部心室肌，立即置于4％多聚甲醛(pH 7.4)中固定24小时(4 ℃)，常规石蜡包埋，并作心脏横断切片(5 μm)。应用改良的末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)^［2］原位标记心肌凋亡细胞核中的DNA片断3′-OH末端(In Situ Cell Death Detection Kit,POD 购自德国宝灵曼公司)，以DAB显色，苏木素复染，封片后显微观察、摄影。步骤中不加TdT酶者作为阴性对照；正常的心肌组织以DNaseⅠ(10μg/ml)消化诱导DNA链断裂后再按TUNEL法操作者作为阳性对照。光镜下，正常心肌细胞核呈蓝色，而凋亡阳性心肌细胞核呈棕黄色。半定量分析：每只大鼠观察5张切片，每张切片计数5个高倍视野(high power field,HPF,400×)中凋亡阳性心肌细胞核数目及其占总细胞核数目的比例，求其均值。

5.心肌细胞超微结构观察:取上述各组大鼠左心室游离壁中部心室心肌标本(约1 mm³大小),立即置于冰冷的4％戊二醛(pH 7.2)固定1小时，常规制样用日本产H-600型透射电子显微镜观察(放大倍数500～17 000倍)。每只大鼠观察5张切片。

6.统计学分析:多组间比较用F检验，多组间两两比较用Newman-Keuls检验，不同变量的相互关系用直线回归分析。实验数据用±s表示。

结果

1.SHR体重、收缩压、心率、心肌肥厚指数和CHF病理改变情况(表1):1月龄SHR组未见左、右心室肥厚征象，10月龄SHR组有明显的LVH，但不存在右室肥厚的特征，18～20月龄SHR组均存在明显的左、右心室肥厚，且同时伴有腹腔、胸腔和心包积液及心房血栓等CHF的特征。另外，10月龄SHR组的收缩压(SBP)显著增高，18～20月龄SHR组的SBP和心率(HR)均显著增高。

2.不同年龄SHR和WKY心肌细胞凋亡的变化(表2):1月龄SHR组(NLVH组)心肌细胞凋亡显著增加，其凋亡阳性心肌细胞核数目及其占总细胞核数目的百分率(心肌细胞凋亡指数)均显著高于正常对照组（1月龄WKY组，P均＜0.01）。当SHR发生明显LVH后(10月龄SHR组,LVH组)，心肌细胞凋亡显著减少,其凋亡阳性的心肌细胞核数目和心肌细胞凋亡指数与10月龄WKY组比较,有非常显著的统计学差异(P均＜0.01)。SHR存在明显的CHF时(18～20月龄SHR组,CHF组),心肌细胞凋亡又显著增加，其凋亡阳性心肌细胞核数目和心肌细胞凋亡指数与18～20月龄WKY组比较均显著增加(P均＜0.01)。对不同年龄SHR组间心肌细胞凋亡进行比较，结果显示:1月龄SHR组和18～20月龄SHR组凋亡阳性心肌细胞核数目和心肌细胞凋亡指数均显著