关键词： 柯萨奇病毒B组；心肌炎；心肌疾病；聚合酶链反应

【摘要】目的探讨柯萨奇B₃病毒感染与心肌炎及扩张型心肌病的病原学关系。方法应用生物素标记的核苷酸直接掺入法，建立了原位逆转录PCR反应技术，检测心肌炎、扩张型心肌病患者的心肌活检标本及正常心肌的尸检标本中的柯萨奇B₃病毒。结果16例病理学及临床诊断为心肌炎患者的心肌组织中，7例检测到柯萨奇B₃病毒RNA；14例病理学及临床诊断为扩张型心肌病的患者心肌组织中，5例检测到柯萨奇B₃病毒RNA；16例正常心肌标本中检测结果均为阴性。结论部分心肌炎及扩张型心肌病患者心肌组织中存在柯萨奇B₃病毒RNA，提示柯萨奇B₃病毒感染与部分心肌炎及扩张型心肌病的发病有关。

Detection of the Coxsackie virus B₃ RNA from myocardial tissue by in situ RT-PCR

ZHAO Dechao, GUAN Zhenzhong, ZHANG Fengmin. Department of Cardiology of the 2nd Affiliated Hospital, Department of Microbiology, Harbin Medical University, Harbin 150086

【Abstract】ObjectiveTo study the relationships between Coxsackie virus B₃ (CVB₃) infection and the etiology of myocarditis and dilated cardiomyopathy. MethodsWith biotin-labeled DNA probe, the in situ RT-PCR for detection of CVB₃ RNA in myocardial samples of myocarditis and dilated cardiomyopathy was established. ResultsPositive signals were obtained in the 7 out of 16 myocardial biopsy samples from patients with post-myocarditis and 5 out of 14 from patients with dilated cardiomyopathy. The patients' diagnoses were all confirmed by the pathological and clinical examinations. No positive signals were detected in the 16 normal myocardial biopsy samples. ConclusionCVB₃ RNA′s existing in some of myocardial tissues of myocarditis and dilated cardiomyopathy showed that there was a link between CVB₃ infection and the etiology of myocarditis and dilated cardiomyopathy.

【Key words】Coxsackieviruses Bmyocarditismyocardial diseasespolymerase chain reaction

心肌炎和扩张型心肌病是心血管疾病中的常见病，严重危害人类健康，国内外学者十分重视其病因学的研究。目前多采用PCR和原位杂交技术来探讨柯萨奇B组病毒感染与心肌疾病的关系。其中，PCR法敏感性高，但不能对细胞或组织中的病毒RNA进行定位检测；原位杂交法虽可定位，检测敏感性却不高。原位PCR技术将PCR的高效扩增与原位杂交的细胞定位相结合，在组织细胞内原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列^［1，2］。该技术自1990年由Hasse创立以来，主要用于人类免疫缺陷病毒（HIV）、人类乳头瘤病毒（HPV）、肝炎病毒等方面的检测，笔者尚未见应用于心肌组织中柯萨奇B组病毒的检测报道。本研究成功地建立了原位逆转录PCR技术，对心肌炎及扩张型心肌病中柯萨奇B₃病毒RNA进行了检测，获得满意结果。

资料与方法

1.实验材料：（1）心肌标本：16例经病理学及临床诊断为心肌炎患者的心肌活检标本及14例经病理学及临床诊断为扩张型心肌病患者的心肌活检标本取自哈尔滨医科大学第二附属医院循环内科入院病例，16例正常心肌标本取自意外事故死亡者的尸检心肌标本，经病理检查未见病变。（2）柯萨奇B组病毒nRT-PCR基因扩增试剂盒：上海复生生物工程研究所提供。（3）生物素-11-dUTP及亲和素显色系统：购于北京医科大学。

2.实验方法：（1）预处理：5 μm厚的心肌标本石蜡切片上加蛋白酶K（1 μg/ml），37℃消化10分钟→PBS冲洗→梯度乙醇脱水→加DNase(1 U/50 μl) 50 μl湿盒内室温过夜→PBS冲洗→梯度乙醇脱水。（2）原位逆转录PCR：加逆转录反应液42℃作用20分钟→PBS冲洗→梯度乙醇脱水→加PBS反应液、生物素-11-dUTP→加盖玻片，四周密封→置于PCR仪上，60℃ 5分钟后→96℃ 1分钟、55℃ 2分钟、72℃ 2分钟循环40次→末次延伸72℃ 7分钟。（3）显色：泡去盖玻片→PBS洗涤→乙醇脱水→加链抗生物素碱性磷酸酶（0.5 mol/L，50 μl），37℃ 30分钟→PBS洗涤→NBT和BCIP显色反应，37℃ 2小时→TE终止反应→纯水冲洗→光镜下观察，以出现蓝紫色为阳性信号。

结果

原位逆转录PCR法检测16例心肌炎患者心肌活检标本中的柯萨奇B₃病毒RNA，7例得到阳性结果，即心肌组织中出现蓝紫色阳性信号（图1）；14例扩张型心肌病患者心肌活检标本中，5例获阳性结果（图2）；而正常心肌的尸检标本中均为阴性结果（图3）。本实验表明，部分心肌炎和扩张型心肌病的发生与柯萨奇B₃病毒有关。

图1原位RT-PCR法检测病毒性心肌炎患者心肌组织中CVB₃ RNA结果：可见感染细胞内蓝紫色阳性信号(显色系统：碱性磷酸酶—BCIP，NBT;放大倍数：40倍。图2，3同此)

图2原位RT-PCR法检测扩张型心肌病患者心肌组织中CVB₃ RNA结果：可见细胞内蓝紫色阳性信号

图3原位RT-PCR法检测正常心肌组织中CVB₃ RNA结果：未见阳性信号

讨论

国内外学者认为，柯萨奇B组病毒感染是引起病毒性心肌炎的主要因素，而在扩张型心肌病的多因素学说中，柯萨奇B组病毒感染学说也占重要地位。

大量报道证实，多种免疫学方法可以找到柯萨奇B组病毒特异抗原。并且自从原位杂交技术和PCR技术应用以来，相继有学者检测到心肌炎及扩张型心肌病患者心肌组织中的病毒RNA，为临床诊断提供了直接证据^［3］。并提出分子生物学技术在确定肠道病毒感染与心肌疾病关系上优于免疫学方法。而原位PCR法是在原位杂交和PCR技术的基础上建立起来的，能在组织细胞原位进行病毒RNA扩增和定位检测的方法^［4］。最近，可以用该方法在柯萨奇B组病毒感染的细胞中成功地检测出病毒RNA^［5］，但尚无用于心肌组织中病毒检测的报道。

本实验用原位逆转录PCR法 检测了16例心肌炎患者的心肌活检 标本，7例获阳性结果。14例扩张型心肌病患者中有5例获阳性结果。证明柯萨奇B组病毒感染不仅与心肌炎的发病有关，而且可能与扩张型心肌病相关。因此，预防肠道病毒感染，特别是预防柯萨奇B组病毒感染对减少病毒性心肌炎和扩张型心肌病的发生有重要意义。

同时值得提出的是，原位逆转录PCR法是一种快速准确的分子生物学方法，在临床的诊断上具有实用价值。

参考文献

1Patel VG, Shum-Siu A,Heniford BW,et al. Detection of epidermal growth factor receptor mRNA in tissue section from biopsy specimens using in situ polymerase chain reaction. Am J Pathol, 1994,144:7.

2Bagasra O, Hauptman SP, Lischner L, et al. Detection of human immunodeficiency virus type 1 provirus in mononuclear cells by in situ polymerase chain reaction. N Engl J Med, 1992,326:1385.

3赵德超, 关振中, 张凤民，等. 原位RT-PCR法检测柯萨奇B₃病毒感染HeLa细胞中的病毒RNA. 哈尔滨医科大学学报, 1998,32:243-244.

4彭天庆，杨英珍，牛存龙，等.RNA-RNA原位杂交检测心肌中的肠道病毒RNA.中华心血管病杂志，1995,23:111-112.

5Nuovo GJ, Gallery F,MacConnell P, et al. An improved technique for the in situ detection of DNA after polymerase chain reaction amplification. Am J Pathol,1991,139:1239-1244.

收稿:1999-08-18修回:1999-09-30