1990年Ozawa T 等人首先报道肥厚型心肌病（HCM）患者心肌细胞中存在线粒体DNA（mtDNA）的多重缺失。随后，Zeviani M和Silvestri G等人在家族性及散发的心肌病患者中又分别发现mtDNA 3260、9997等位点的突变，这些点突变改变了进化上高度保守的氨基酸，被认为是某些HCM的致病原因。在过去的研究中，我们也已发现在某些HCM患者的mtDNA中有缺失突变。最近我们应用聚合酶链反应-DNA单链构象多态技术(PCR-SSCP)及PCR产物直接银染测序技术对26例散发的HCM患者心肌、骨骼肌及血细胞共32份标本中的mtDNA进行突变分析,以探讨HCM与mtDNA点突变的关系。

一、 资料与方法

1. 对象:(1)HCM患者26例，其中获得3例患者的外周血及骨骼肌标本，3例患者的外周血及心肌标本，另外20例均为血标本。诊断标准：HCM按照超声心动图室间隔或心室肌层≥13 mm,根据病史、心血管造影、心导管检查等排除冠心病、高血压性心脏病、先天性心脏病等引起继发性心肌肥厚的疾病入选。(2)正常对照10例。(3)高血压病患者9例，该9例患者超声心动图室间隔或心室肌层≥13 mm。正常对照及高血压病患者均取其外周血标本。

2. 方法：(1)DNA的提取：常规苯酚/氯仿法抽提患者心肌、骨骼肌及周围血细胞的基因组DNA(内含mtDNA)。(2)PCR扩增：采用Perkin/Cerus公司的热循环仪进行扩增，所用的一对引物由中国科学院上海细胞生物学研究所合成，扩增的这段特异的mtDNA为NADH脱氢酶亚单位4所编码。(3)PCR产物的SSCP 检测：采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法。(4)PCR产物的纯化：采用High Pure PCR Product Purification药盒(Boehringer mannheim)进行纯化。(5)序列分析：按常规双脱氧末端终止法进行测序，试剂为Silver Sequence TM DNA Sequencing System(Promege 公司)的测序试剂。

二、结果

1. PCR-SSCP结果：发现其中3例HCM患者的电泳图谱与正常对照个体不同，提示这3例患者在PCR扩增的片段存在基因突变。高血压病患者与正常对照无明显差异。

2. 核苷酸序列分析：对经PCR-SSCP筛查有突变的3例患者的mtDNA进行测序分析。1例患者mtDNA H链第11856位点发生T→G突变，导致天冬酰胺(Asn)变成苏氨酸(Thr)；另2例患者在L链第11742位点G→A，导致半胱氨酸(Cys)变成酪氨酸(Tyr)。该突变均为杂质性，即同一标本除存在突变的mt-DNA外，在相应位置同时有正常的mt-DNA。

三、讨论

线粒体是细胞氧化磷酸化（OXPHOS）产生能量的场所，OXPHOS所需的酶是由核DNA与mtDNA共同编码的。mtDNA因不与组蛋白结合，易受活性氧等自由基损伤，其损伤率比核DNA高16倍。而mtDNA各基因排列紧密，除与mtDNA复制、转录有关的一小段区域外，不含内含子序列，因此mtDNA中的任何突变都会累及到基因组中的一个重要功能区。线粒体OXPHOS产生的ATP对于心脏维持正常功能至关重要，mtDNA点突变会影响这一产能途径，使ATP生成减少，导致心脏功能异常。

我们选择11641—11980区域，其属于复合物I （COI）NADH脱氢酶亚单位4功能区（ND₄），采用PCR-SSCP以及PCR产物直接银染测序技术对26例HCM患者的mtDNA进行筛查，以探讨心肌病与mtDNA编码的多肽之间的关系。结果发现3例HCM患者外周血标本存在mt-DNA点突变，其骨骼肌、心肌标本未曾获得。有资料显示，肌肉组织与外周血相比，能积累更多的突变型mtDNA，由此推断，从患者的肌肉组织中亦能检测到mtDNA突变。序列分析显示：1例患者在11856位点发生了T→G的颠换，导致人类线粒体DNA COI ND₄功能区第366位高度保守的天冬酰胺(Asn)变成苏氨酸(Thr),另2例为11742位点的G→A的颠换，导致人类线粒体DNA COI ND₄功能区第328位高度保守的半胱氨酸(Cys)变成酪氨酸(Tyr),COI-IV组成电子传递链，来自线粒体外的电子经COI传递至线粒体内，再经COIII、IV传递至O₂，通过OXPHOS偶连机制驱动ATP的合成，因此，mtDNA ND₄功能区11856、11742位点的碱基置换造成保守氨基酸的改变，必然导致COI的功能缺陷，影响OXPHOS，使ATP产出下降。心肌组织在能量不足的情况下，会发生退行性改变及代偿性肥厚增生等病理变化，从而导致疾病的发生。

家系的研究及心肌、骨骼肌、血标本的对照研究有待于进一步证实。

本课题受江苏省卫生厅基金资助(H9512)

收稿:1999-04-19修回:1999-10-10