心肌缺血时心肌利用葡萄糖明显增多，缺血细胞摄取葡萄糖量的高低与葡萄糖通过细胞膜转运率相关。本研究建立在体犬低血流心肌缺血模型，观察急性心肌缺血时心肌葡萄糖转运子GLUT₄的分布和移位。

1.方法：用成年雄性犬9条，通过水压闭塞器使左冠状动脉前降支远端压下降50%，左室前壁发生低血流心肌缺血。采集左冠状动脉前降支缺血区和左室后壁非缺血区静脉血测定葡萄糖浓度。取10克缺血和非缺血内壁心肌，置入20%匀浆液(250 mmol/L蔗糖，10 mmol/L碳酸氢钠，5 mmol/L叠氮钠)，匀浆(8 000转/min)和离心(1 200 g/10 min)各2次，留上清液，190 000g离心1小时，制备蔗糖梯度(25%、30%、35%)，150 000 g离心20小时，细胞膜成分从25%蔗糖的上半层收集，细胞内膜成分为30%和35%蔗糖层交界处收集，以10 mmol/L碳酸氢钠，5 mmol/L叠氮钠溶液稀释各膜成分，190 000g离心1小时，以250 mmol/L蔗糖、50 mmol/L ris(pH 7.4)溶液悬浮沉淀，所有过程在4℃进行。

Western印迹分析GLUT₄：膜标本蛋白20 μg，以Laemmli含有2% SDS，3% DDT液稀释，于10% SDS-PAGE凝胶，200 V，电泳45分钟，200 mA/1h将蛋白转至PVDF膜，置膜于GLUT₄抗体-1%牛奶-PBS和2uCi ¹²⁵I-1%牛奶-PBS中，各温育1小时，-80℃自动曝光，依X线片定位，剪切相应PVDF膜带，γ-计数仪计量。

免疫荧光定位检测GLUT₄：取缺血区和非缺血区全层心肌切片(5 μm)，加GLUT₄抗体，温育2小时，Rhodamine标记羊抗兔IgG温育1小时，同焦点显微镜下检测。

以每微克蛋白结合¹²⁵I-蛋白A的DPM和膜蛋白量计算膜成分GLUT₄量，每膜成分量为其占总膜GLUT₄百分率。

2.结果：心肌缺血前缺血和非缺血区葡萄糖摄取量均较低(0.13±0.07)、(0.15±0.06) mmol/L，缺血期缺血区葡萄糖摄取量增多(0.81±0.15) mmol/L，非缺血区无变化(0.19±0.07) mmol/L。

细胞膜钠泵活力高(16.4±0.4)，钙泵活力低(2.0±0.4)，内膜则相反(6.0±0.9；30.3±3.0μmol Pi·mg protein^-1.h^-1)，缺血区与非缺血区结果类似。免疫印迹法和化学荧光法检测细胞膜钠泵α₁亚基和内质网钙泵亦获相似结果。

在非缺血心肌，GLUT₄主要存在于细胞内膜，细胞膜GLUT₄含量15%±2%。缺血使GLUT₄从内膜向细胞膜移位，缺血区与非缺血区相比，细胞膜GLUT₄含量增加2倍(15%±2%～30%±3%，P＜0.02)，内膜GLUT₄则相应减少(85%±2%～70%±3%，P＜0.02)。缺血也增加细胞膜GLUT₄密度73%±24%，P＜0.02；内膜GLUT₄密度则相应减少。心肌缺血时细胞膜与内膜GLUT₄密度比率亦明显增加(0.22±0.06～0.58±0.38，P＜0.02)。免疫荧光定位亦证实非缺血区心肌GLUT₄主要存在于细胞内膜，少许位于细胞膜；心肌缺血时，GLUT₄主要出现在细胞膜，同时伴内膜GLUT₄减少。

3.讨论：用蔗糖梯度分离心肌细胞膜和细胞内膜，前者钠泵活力高，钙泵活力低，后者两泵活力则相反，所获亚细胞膜纯度高，完全适于GLUT₄移位的研究。生理状态时GLUT₄主要位于细胞内膜，细胞摄取葡萄糖量与GLUT₄移位相关。本研究模型近似临床的急性低血流心肌缺血。缺血时心肌摄取葡萄糖增加伴随GLUT₄从内膜向细胞膜移位，细胞膜GLUT₄量增加近2倍。同焦点显微镜下观察心肌细胞，亦发现非缺血区细胞膜GLUT₄荧光标记弱，缺血区荧光标记强，支持心肌缺血引起GLUT₄从内膜向细胞膜移位。低血流心肌缺血使细胞内膜GLUT₄移位可增加心肌葡萄糖摄取量，故GLUT₄移位在缺血心肌能量代谢中起着重要的调节作用。

收稿：1998-06-09修回：1998-09-14