关键词： 细胞；表型；蛋白激酶类；聚合酶链反应

【摘要】目的建立血管平滑肌细胞(VSMC)的收缩及合成表型, 探讨蛋白激酶Cα(PKCα)亚型对其转化的影响。方法用酶消化法及传代培养分别获2种VSMC表型细胞, 细胞特性通过免疫细胞化学及透射电镜鉴定。用竞争性逆转录聚合酶链反应(竞争RT-PCR), 观察2种表型细胞的PKCα表达。结果酶消化法分离的 VSMC较传代培养的VSMC显示缬蛋白(desmin)表达呈强阳性。2种表型细胞经超微结构观察分别显示典型的收缩表型及合成表型变化。 PKCα表达在酶消化法分离的VSMC中明显高于传代培养的VSMC(t=3.568;P＜0.05)。结论PKCα亚型在收缩表型的表达量明显高于合成表型, 提示该亚型对维持 VSMC的收缩表型起了一定作用。研究中选用竞争RT-PCR方法克服了以往使用β-actin的局限性。

Phenotypic transition of vascular smooth muscle cells and protein kinase Cα

GAO Pingjin, ZHU Dingliang, CHEN Yuying, et al. Shanghai Institute of Hypertention, Rui-jin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai, 200025

【Abstract】ObjectiveThe purpose of this study was to investigate the expression of protein kinase Cα(PKCα) in two phenotypic states of vascular smooth muscle cell (VSMC) by establishing contractile and synthetic phenotype.MethodsVSMC enzymatically isolated from rat aorta were of contractile phenotype while the passaged cells were of synthetic phenotype. The cell phenotypes were identified by transmission electron microscopy and immunocytochemical staining. The gene expressions of PKCα were determined by competitive reverse transcriptase-PCR (RT-PCR).ResultsThe freshly dispersed VSMC were positively stained by desmin antibodies compared with passaged VSMC. The two type of cells showed typical morphology of contractile and synthetic phenotypes, respectively. The expression of PKCα in freshly dispersed VSMC was significantly higher than that of VSMC of synthetic phenotype (t=3.568;P＜0.05). ConclusionThe present data demonstrate an association between PKCα expression and phenotypic transition. It is proposed that PKCα plays a distinct role in sustaining contractile phenotype of VSMC. The competitive RT-PCR used in this study overcomes the limitations of β-actin method.

【Key words】cellsphenotypeprotein kinasespolymerase chain reaction

血管平滑肌细胞(VSMC)根据结构与功能的差异,分为收缩型和合成型2种表型^［1］。收缩型VSMC呈分化状态, 不能增殖;而合成型VSMC呈去分化状态, 具有强增殖能力。因此,VSMC表型转化是促进细胞增殖的主要因素。

蛋白激酶C(PKC)作为细胞信息传递的关键酶,在细胞增殖和分化的调节中起重要作用^［2］。但在高血压领域, 研究PKC亚型与表型转化的关系尚少见报道。本研究通过体外细胞培养, 分别建立收缩表型和合成表型细胞, 并采用竞争性逆转录聚合酶链反应法检测PKCα亚型在2种 VSMC表型中的表达。

材料与方法

l.细胞分离与培养: 采用纯种6～8周雄性 Wistar-Kyoto大鼠(WKY), 分离主动脉,去除内膜与外膜,用酶消化法(胶原酶3 mg/ml, 弹性蛋白酶1 mg/ml,大豆胰蛋白酶抑制剂1 mg/ml,牛血清白蛋白1 mg/ml)分离 VSMC，原代培养获收缩表型细胞,经传代培养获合成表型细胞。

2.免疫细胞化学: 将酶消化法及传代培养分别获得的VSMC分别滴种于盖玻片上, 贴壁生长后, 依次作如下处理: 3 ％多聚甲醛固定→漂洗→封闭→缬蛋白(desmin)单抗→漂洗→双抗→显微镜下观察, 适时终止反应。

3.透射电镜: 将酶消化法及传代培养分别获得的VSMC用2％戊二醛固定,轻轻刮下细胞,离心沉淀,脱水包埋,超簿切片电子染色后透色电镜下观察。

4.竞争性逆转录聚合酶链反应(竞争RT-PCR): 总RNA提取: 将酶消化法及传代培养分别获得的VSMC加入TRIzol试剂(GIBCO公司)1 ml, 反复吹打, 加氯仿200 μl, 振荡15秒, 4 ℃ 12 000 g离心15分钟, 取水相, 加500 μl异丙醇, -20 ℃过夜, 4 ℃ 12 000 g离心15分钟, 弃上清, 75 ％乙醇洗涤, 800 g离心10分钟,沉淀以适量DEPC水溶解, 紫外分光光度计测OD值。

逆转录(RT): 取RNA 2 μg, 加水至8 μl, 65 ℃变性5分钟。加5×缓冲液4 μl、DTT 2 μl、RNAsin (BOEHRINGER公司)0.5 μl、 M-MLV逆转录酶(GIBCO公司) 1 μl, 加水至总体积20 μl, 37℃孵育 l小时。然后经95℃水浴5分钟, -20℃保存。

引物合成并纯化: PKCα竞争引物为5′端: 5′-TGA ACC CTC AGT GGA ATG AGT-3′和3′端: 5′-GGC TGC TTC CTG TCT TTC TGA ACT TGG CTT TCT GAA C-3′。PKCα目的引物为5′端: 5′-TGA ACC CTC AGT GGA ATG AGT-3′和3′端: 5′-GGC TGC TTC CTG TCT TCT GAA-3′。 PCR条件为94℃ 15秒, 59℃ 15秒, 74℃ 45秒, 共26个循环。竞争片段长度为293 bp, 目的片段长度为325 bp, 分别用柱离心式胶纯化试剂盒(上海华顺生物制剂公司)进行纯化。

建立标准曲线: (1)取逆转录产物2 μl与倍比梯度稀释的纯化竞争片段2 μl共同作为模扳,加入目的引物进行PCR循环。根据电泳结果, 经扫描测定选出二条带灰度基本一致的PCR反应管所加入的竞争片段浓度用于标准曲线制作。(2)取该竞争片段2 μl与倍比梯度稀释的纯化目的片段2 μl共同作为模板, 加入目的引物进行PCR循环。电泳结果经图像扫描获各条带密度, 以各目的片段量的对数值为横坐标, 而系列PCR管各自目的片段及竞争片段密度比值的对数值为纵坐标, 作线性回归方程。

竞争 PCR: 二种表型VSMC的RT产物, 首先用β-actin确定RT效率一致,然后分别加入竞争片段与目的引物共同PCR。结果经图象扫描得目的片段与竞争片段的密度比, 根据直线回归方程求出该样本mRNA的表达量^［3］。

结果

1.细胞表型鉴定: 免疫细胞化学结果显示,酶消化法分离的VSMC, 缬蛋白表达呈强阳性;而传代培养的VSMC, 缬蛋白表达呈弱阳性(图1)。透射电镜结果显示, 酶消化法分离的VSMC, 细胞核内见大量异染色质, 胞浆充满肌丝,线粒体丰富,内质网不发达; 而传代培养的VSMC,细胞核内主要为常染色质,胞浆含丰富的粗面内质网膜囊,高尔基氏体发达,肌丝难以辩认(图2)。

图1免疫细胞化学显示Desmin表达结果。1a为酶消化法VSMC，Desmin表达呈强阳性；1b为传VSMC，Desmin表达呈强阳性

图2透射电镜显示超微结构(20 000×)(注：图2a为酶消化法VSMC，细胞核内有大量异染色质，胞浆内含大量肌丝；图2b为传代VSMC，细胞核以常染色质为主，胞浆内仅少量肌丝)

2.PKC亚型表达结果: 选用PKCα竞争片段作为内标,确定内标浓度为1.88 fg/μl。进一步得直线回归方程: lgT/C＝1.6031gX-2.58 r=0.963 P＜0.01(T代表目的片段的密度值,C代表竞争片段的密度值,X代表待测样本的mRNA表达量；图3)。根据此方程,计算酶消化法分离的 VSMC组 mRNA含量为284.96±48．21；传代VSMC组mRNA含量为160.2±50.53。两组比较差异有显著性(n＝4,t＝3.568，P＜0.05；图4)。

图3PKCα亚型竞争性RT-PCR标准曲线示意图(注：上图为

标准曲线电泳结果，325 bp为目的片段，293 bp为竞争片段；下图为密度扫描数据的直线回归图)

图4PKCα亚型mRNA表达结果(注：β-actin为确定RT效率的标准，325 bp为待测样本，293 bp为竞争片段；1=传代VSMC，2=酶消化法VSMC)

讨论

近年来的研究表明, VSMC表型改变是促进高血压血管病变的基础^［4］。但要进行该项研究的前提是获得准确无误的收缩型和合成型二种表型细胞,目前尚无特异的鉴定二种表型细胞的标志。Thyberg等^［1］指出,细胞表型从收缩型到合成型的转化过程中,虽有一些标志如α-actin量的变化, 但均不能作为该转化的良好标志。

本研究用免疫细胞化学方法表明,酶消化法分离的VSMC,其缬蛋白的表达明显高于传代培养的VSMC, 提示在细胞表型的转化过程中, 有明显的缬蛋白量的变化, 这与Haller等^［5］的报道相一致。本研究进一步用透射电镜证实,二种培养方法获得的VSMC, 其超微结构变化特点与国外报道相符^［1］。因此,本研究结果