关键词： 再狭窄；支架；基因治疗

【摘要】目的为了评估蛋白涂层金属支架局部转染尿激酶前体(Pro-UK)基因对冠状动脉内血小板沉积、早期血栓形成和平滑肌细胞增生的影响。方法金属支架涂层为交联明胶制成。载体为复制缺陷的、携载Pro-UK基因的重组腺病毒。采用标准球囊导管技术，将携带有Pro-UK基因的蛋白涂层支架置入小型猪冠状动脉前降支中段，以相同方法置入单纯蛋白涂层支架或裸露支架做为对照。结果支架置入后3天，Pro-UK基因转染血管段(n=6)¹¹¹In标记血小板及扫描电镜显示：血小板沉积和纤维蛋白形成明显少于对照血管(P＜0.05)。在基因转染后7天RT-PCR(n=2)和免疫组化染色(n=1)证实，有Pro-UKmRNA的表达及Pro-UK蛋白质生成。3个月后冠状动脉造影显示：Pro-UK基因转染组(n=4)无再狭窄发生，而对照组(n=8)均发生再狭窄，组织病理学形态分析结果显示：在Pro-UK基因转染组(n=4)，平均新生内膜厚度，新生内膜面积和百分狭窄面积均明显小于对照组(n=8,P＜0.05)。结论在再狭窄动物模型上，通过蛋白涂层支架，Pro-UK基因在腺病毒载体介导下能被直接导入血管成形部位，并预防再狭窄的发生。

Intracoronary prourokinase gene transfer with protein-coated

stent prevents coronary restenosis in mini-swine

YUAN JinqingGAO RunlinSHI Ruiwenet al

Cardiovascular Institute & FU Wai Hospital, CAMS & PUMC, Beijing 100037

【Abstract】ObjectiveTo assess the effect of adenovirus -mediated local prourokinase (Pro-UK) gene transfer using protein -coated metallic stents on platelet deposition, early thrombosis and smooth muscle cell proliferation after intracoronary stent implantation.MethodsThe metallic stent was coated by cross-linked gelatin. A replication-defective recombinant adenovirus carrying Pro-UK gene was used. The coated stents were mounted on 3.0 mm PTCA balloon and submersed into high titer Ad-prourokinase viral stock (2×10¹⁰pfu/ml) for 3 minutes. Protein -coated stainless steel stents and bare stainless steel stents were used as controls. All stents were implanted into the middle segment of LAD through 8F large lumen guiding catheter (The ratio of balloon to vessel diameter was 1.1-1.3:1).ResultsAt the 3rd day after stenting, in comparison to control vessels (n=6),there was less ¹¹¹In-platelet deposition in Pro-UK gene transferred vessels (n=6,P＜0.05). Scanning electron microscopy showed that platelet deposition and fibrin formation were significantly less than those in the control group (n=6). At the 7 th day after stenting, RT-PCR (n=2) and immunohistochemical staining (n=1) confirmed the expression of Pro-UK mRNA and the presence of Pro-UK protein at the site of gene transfer. After 3 months of stenting coronary angiogram showed that in all animals with the coated stents loading and Pro-UK gene (n=4) no restenosis and thrombosis occurred, while in the control groups (n=8) restenosis developed in all animals. Meanwhile recanalized, organized thrombosis and old myocardial infarction in the anterior wall with aneurysm formation was revealed in 2 animals. Morphometric analysis showed that in the Pro-UK gene group (n=4), mean neointimal thickness, neointimal area and mean percent area stenosis were significantly less than those in the control groups (n=8, P＜0.05).Conclusion(1)Restenosis animal model can be successfully produced by oversized stent. (2) Protein-coated stent can deliver locally adenovirus-mediated Pro-UK gene to stenting site and may prevent coronary restenosis.

【Key words】restenosisstentgene therapy

再狭窄仍是冠状动脉内支架术后的主要缺陷，据报道^［1］，球囊成形术后局部给予尿激酶可减少血小板沉积，并有效治疗血栓形成。若足量尿激酶在局部持续发挥作用，则一方面可能减少血栓形成，另一方面可能通过抑制血小板沉积而减少平滑肌细胞增生，进而减少再狭窄率。然而局部给药的剂量和药物持续时间受到明显限制^［1］。我们设想：以支架携带尿激酶前体(Pro-UK)基因，置入冠状动脉后可能在局部表达足量的Pro-UK，并发挥其生物学效应。由支架转染目的基因的可行性，迄今国内外尚未见报道。我们已报道了在腺病毒介导下，由蛋白涂层金属支架向局部动脉壁转染LacZ基因有效可行^［2］，本研究的主要目的是为了评估：蛋白涂层金属支架在冠状动脉内局部转染Pro-UK基因对血小板沉积、血栓形成和平滑肌细胞（SMC）增生的影响，观察其预防再狭窄的效果，以期探索一种对临床有实用价值的基因治疗预防再狭窄的新途径。

材料与方法

1.实验动物：选用4～6个月龄、体重为50～60公斤的正常小型猪33只，雌雄不限，实验期间动物喂饲普通谷物饲料(中国农业大学提供)。

2.支架及涂层方法：见文献报道^［2］。

3.重组腺病毒载体：以一种复制缺陷的重组腺病毒做为载体，使该载体携带有尿激酶前体基因(Pro-UK)，其编码产物为尿激酶前体(由北京医科大学心血管研究所构建并提供)，其效价为10¹⁰pfu/ml。

4.血管局部转基因：将实验用小型猪随机分为治疗组15只，对照组18只。将动物称取体重后，按以前报告^［2］的方法麻醉并采用球囊导管技术将携带有Pro-UK基因的蛋白涂层支架置入前降支中段(n=12)，球囊直径为3.0mm(VIVAPRIMO,SCIMED)。以相同方法置入裸露支架(n=8)和单纯涂层支架(n=8)做为对照(球囊与血管直径之比为1.1～1.3:1)。所有动物在支架置入后15分钟重复造影证实管腔通畅，无并发症发生。术后结扎股动脉，缝合伤口，并常规肌注青霉素3天，术中经股动脉注入肝素200IU/kg，术后不给以抗凝剂及阿司匹林。

5.局部转染Pro-UK基因对血小板沉积的效应：在Pro-UK基因转染后3天，12只小型猪(实验组及对照组各6只)按前述方法麻醉^［2］，常规分离提取血小板，于血小板悬液内逐渐滴加¹¹¹In-oxine溶液18.5MBq(0.5mCi)。将¹¹¹In标记血小板混悬液2ml经颈静脉注入体内，1小时后开胸取出置入支架的冠状动脉节段，用生理盐水轻轻冲洗，剥离外膜，并置于γ计数井中计数，同时抽取全血标本以确定游离和细胞结合¹¹¹In活性，测定血小板计数和凝血酶原时间(PT)。血小板沉积数按Johnstone等^［3］所采用的公式计算。

6.免疫组织化学检查：在Pro-UK基因转染后7天，基因转染组及对照组各1只动物采用特异性Pro-UK抗体(中国军事医学科学院生物医学工程所惠赠)进行免疫组化染色(ABC法染色)。

7.RNA的提取和RT-PCR检测扩增目的基因：血管RNA的提取按照Chomczynski和Sacchi建立的AGPC一步法进行^［4］。按常规方法逆转录合成cDNA。Pro-UK引物的合成根据Holems等^［5］报道的序列进行。其碱基序列如下：

Pro-UKF1：5′GAA CAT CAT CAA GTT CCA TCG 3′

R1：5′ TGT GGC GCT GAT CAC CCA GC 3′

Pro-UK基因扩增完毕后，取PCR产物10μl，在1%琼脂糖凝胶上进行常规电泳，紫外光下拍照。用显像光密度扫描仪分析灰度OD值，其代表Pro-UK－mRNA的相对含量。本实验以GAPDH作为实验参照物。

8.冠状动脉造影检查：在支架置入后3个月重复造影以证实管腔是否通畅，有无并发症发生。通过ANCOR计算机心血管图像分析系统测定管腔狭窄直径。

9.组织病理学检查：在支架置入后3天及3个月所有动物经前述方法麻醉^［2］开胸后即刻分离冠状动脉，分别将冠状动脉经10%中性缓冲福尔马林加压(100mm Hg)灌注固定24小时或2.5%戊二醛固定24小时。固定后将包含有支架的冠状动脉节段游离，分别制备塑料包埋切片和扫描电镜标本，光镜标本经HE及弹力(Weigert)染色后，由显微微机彩色图像处理系统分别测定新生内膜厚度、新生内膜面积、原始管腔和狭窄管腔横断面积^［6］。新生内膜面积为原始管腔和狭窄管腔面积之差(原始管腔面积－狭窄管腔面积)。血管损伤程度采用Schwartz等^［6］报道的损伤积分标准评估，狭窄百分面积由下列公式计算^［6］：

%狭窄面积＝100×［1－(狭窄管腔面积÷原始管腔面积)］。

10.统计学处理：所有数据由SPSS统计软件进行单因素方差分析，以均数±标准差表示。P＜0.05差异有显著性。

结果

在33只动物中，随机分入治疗组和对照组的动