采用超微量分离提取检测免疫形态学及分子生物学等方法，在人体不同水平上对人心包（壁层）行心包心钠素(atrial natriuretic factor,ANF)的基因表达。

材料与方法

1.材料：选用人新鲜尸体完整心包（壁层）；风心病瓣膜置换术患者心包；Wistar大鼠心脏为对照标本。

2.方法：(1)组织分离提取：心包组织(壁层)煮沸10分钟，制备组织匀浆,离心，取上清液冷冻干燥，放射免疫法(RIA)。高效液相层析(HPLC)时需将组织匀浆经冷丙酮抽提,离心，取上清液冷冻干燥。(2)血浆和尿标本处理：将全血经EDTA-Na₂抗凝得到人血浆，将24小时尿液pH调至7.0后进行RIA。(3)RIA：ANF采用直接放射免疫法。(4)HPLC-RIA：采用流动相为1%三氟醋酸(TFA),0-100%乙氰梯度洗脱,下柱液进行RIA。(5)免疫组织化学:采用免疫胶体金法(IGS)，兔抗ANF抗体1:20，经免疫染色后，标本在JEM2000EX透射电镜下观察。(6)分子生物学:以异硫酸氰胍制备法提取总RNA，ANF-cDNA采用随机引物法,用α－³²P－dCTP进行探针标记，斑点杂交试验。

3.统计学处理：数据经方差分析，t检验，相关分析以均数±标准差表示。

结果

1.人心包ANF：正常人心包壁层(n=6)存在具有免疫活性ANF(ANF-LM)，其在心包上部、中部、下部各部分布分别为(6.17±2.83)ng/g，(3.39±2.60)ng/g，(5.13±1.07)ng/g。风心病心包(n=11)ANF明显增加为(151.08±40.60)ng/g，两者差异具有显著性(P＜0.05)。风心病患者心包ANF与其同一患者的动脉、静脉血浆及尿液ANF比较，均无显著性相关。

2.HPLC-RIA人心包组织提取物中存在3种形式ANF，且具有免疫活性。

3.免疫电镜：胶体金免疫电镜标本在透射电镜下显示，人心包膜表面覆盖一层扁平间皮细胞。采用兔抗人ANF为第一抗体,部分浅染颗粒内有明显金颗粒标记，而对照试验则无上述所见。

4.RNA斑点杂交实验：证明Wistar大鼠心房(对照)和人心包均存在ANF基因转录。大鼠心房ANFmRNA含量高，人心ANFmRNA约为大鼠心房的41.5%(P＜0.05)，差异具有显著性。

讨论

ANF是哺乳动物心脏及多个心外器官产生的具有强大生物活性的肽类激素。我们采用HPLC、RIA、免疫形态学及ANF分子杂交等方法，通过人体不同水平发现：(1)组织器官水平，人心包存在ANF，其含量分布基本相同，心包ANF与血浆和尿液ANF无显著性相关；(2)细胞亚细胞水平，ANF分泌细胞主要是间皮细胞，以囊泡形式储存于间皮细胞胞浆中；(3)生化分子水平，人心包存在具有免疫活性的三种分子形式ANF，循环形式(α－ANF)和储存形式(β-ANF,γ-ANF)；(4)基因水平，人心包存在ANF基因转录和表达，其ANFmRNA水平低于大鼠心房ANFmRNA。本研究证明人心包具有合成、储存与分泌心钠素的能力。本研究对象均为风心病瓣膜置换术患者，心脏明显增大，心包张力增加，心包心钠素明显增加，提示心包心钠素增加可对心衰时心脏内分泌不足起代偿作用。

收稿:1998-06-24修回:1999-04-17