关键词： 肾上腺髓质素；血管紧张素Ⅱ；丝裂素活化蛋白激酶；血管平滑肌细胞

【摘要】目的观察肾上腺髓质素(adrenomedullin ADM)对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)刺激血管平滑肌细胞增生作用的影响。方法测定ADM、Ang Ⅱ对细胞³H-leu掺入及(MAPK)和(PKC)活性的作用。结果Ang Ⅱ促进细胞³H-leu掺入及MAPK和PKC活性增加；ADM对细胞³H-leu掺入及MAPK、PKC活性均无明显影响，但呈浓度依赖方式抑制Ang Ⅱ促细胞³H--leu掺入及MAPK活性增加。结论ADM通过抑制Ang Ⅱ对MAPK的激活，拮抗其促血管平滑肌细胞增生作用。

Adrenomedullin antagonized angiotensin Ⅱ-induced

growth of vascular smooth muscle cells

FEI YuxingLIU GuoshuNIU Dadiet al

Navy General Hospital, PLA, Beijing 100037

【Abstract】ObjectiveWe observed the effects of adrenomedullin (ADM) in angiotensin Ⅱ-induced growth of vascular smooth muscle cells.MethodsThe ³H-leucine (³H-leu) incorporation and MAPK PKC activity in the cultured VSMCs were measured.ResultsAng Ⅱ increased the cultured VSMCs ³H-leu incorporation and MAPK PKC activity significantly; ADM did not influenced the ³H-leu incorporation and MAPK PKC activity alone, but it markedly inhibited the Ang Ⅱ role in stimulating ³H-leu incorporation and activating MAPK significantly in a concentration-dependent manner.ConclusionADM antagonized Ang Ⅱ action by inhibiting MAPK activation.

【Key words】adrenomedullinangiotensin Ⅱmitogen activated protein kinasevascular smooth -muscle cell

肾上腺髓质素(adrenomedullin ADM)具有强大扩血管作用的血管活性多肽。血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)是体内强烈的缩血管活性物质之一，二者对心血管调节的相互作用尚不完全清楚。本研究在培养的人血管平滑肌细胞上，观察ADM对Ang Ⅱ促细胞增生作用的影响，探讨他们相互调节的机理。

资料与方法

血管平滑肌细胞分离和培养：取腹部手术患者非病变部位肠系膜小动脉，按Campbell等^［1］方法分离平滑肌细胞，在细胞培养筛上用DMEM液培养，实验用第4～5代细胞，分为六组：①ADM组：加入10^-7mol/LADM；②Ang Ⅱ组：10^-7mol/L Ang Ⅱ；③～⑤组:加入Ang Ⅱ(10^-7mol/L)和不同浓度ADM(10^-7～10^-9mol/L)；⑥对照组：不做特殊处理。

³H-亮氨酸(³H-leu)掺入：参照Huwller等^［2］方法。制备4×105Cell/ml悬液接种于24孔板培养后，实验各组细胞加入不同试剂孵育20小时后，每孔加入³H-leu37kbq继续孵育4小时，终止反应，经微孔滤膜收集细胞，冲洗烘干后，在β液闪仪上测定放射活性（单位为cpm/孔）。

丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)活性测定:参照李天昌等方法^［3］。实验各组细胞加入上述试剂孵育10分钟后，制备胞浆提取液与MAPK底物髓磷质蛋白(myelin basic protein,MBP)和γ-³²P-ATP 37kbq共同孵育15分钟终止反映，点膜后，测定³²P放射活性（单位为pmol pi/孔）；以实验与空白的差值表示MAPK活性。

蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性测定：参照Fiorani等方法^［4］进行。各组实验结束后，提取细胞溶解液与PKC底物肽和链球菌溶血毒素O，孵育10分钟，加入γ-³²P-ATP 37kbq孵育10分钟，冰浴后离心，点膜，测定³²P放射活性（单位为pmolpi/孔）；以实验与空白的差值表示PKC活性。

ADM、Ang Ⅱ由美国Phoenix Pharmaceuticals公司提供。每次实验进行平行孔操作，实验重复6次，结果以均数±标准误(±s)表示，方差分析、组间Q检验作统计学处理。

结果

Ang Ⅱ促进细胞³H-leu掺入和MAPK、PKC活性增加［较对照组分别增加约2倍(P＜0.01)和3倍(P＜0.01)、5倍(P＜0.01)］；ADM本身对细胞³H-leu掺入和MAPK活性均无明显影响(P＞0.05)；但可呈浓度依赖地方式抑制Ang Ⅱ促细胞增生作用，与单纯Ang Ⅱ比较，不同浓度ADM使³H-leu掺入减少至93.4%、76.3%(P＜0.05)和66.5%(P＜0.01)，MAPK活性降低7.8%、39.6%(P＜0.01)和58%(P＜0.01)。ADM既不改变细胞PKC活性，也不影响Ang Ⅱ对PKC的激活作用。

讨论

血管平滑肌细胞上富含耦联有G蛋白的ADM受体，ADM可以通过增加细胞内cAMP发挥生物学效应；Ang Ⅱ具有促进血管收缩和细胞增生作用。本实验以³H-leu掺入作为细胞蛋白质合成的指标，发现ADM对血管平滑肌细胞蛋白质合成并无明显影响，但呈浓度依赖性地抑制Ang Ⅱ促蛋白质合成作用，并抑制Ang Ⅱ的MAPK激活作用。

MAPK系统是近年来发现的细胞外促细胞增生信号向细胞核传导的共同通道，许多促增殖活性物质，分别通过激活受体酪氨酸激酶和G蛋白途径，相继引起Raf、MAPK激酶和MAPK激活，后者激活转录因子、刺激与细胞增殖有关的基因的转录，促进细胞的生长、分化与增殖。Ang Ⅱ刺激MAPK激活的上游途径可能与PKC的激活有关，活性PKC具有激活MAPK激酶的功能。本实验观察到Ang Ⅱ是PKC和MAPK强激活剂，并发现ADM呈浓度依赖地方式抑制Ang Ⅱ对MAPK的激活，而不影响PKC的激活。文献报道，cAMP可以抑制MAPK的激活，ADM干扰Ang Ⅱ对MAPK的作用是否通过cAMP介导，尚有待进一步已经研究。

参考文献

1Campbell JH, Campbell GR. Culture techniques and their appliccation to studies of vascular smooth muscle. Clin Scien, 1993,85:501-513.

2Huwller A, Stabel S, Fabbro D, et al. Platelet-derived growth factor and angiotensin Ⅱ stimulated the Mitogen-actived proein kinase cascade in renal mesangial cells : camparison of hypertrophic and hyperplastic agonist. Biochem J, 1995, 305:777-784.

3李天昌，庞永正，苏静怡,等. 丝裂素活化蛋白激酶活性测定. 基础医学与临床, 1996，16:158-160.

4Fionari M, Cantoni O, Tasinato A, et al. Hydrogen peroxide and fetal bovine serium-induced DNA synthesis in vascular smooth muscle cells: pasitive and negative regulation by protein kinase C isoforms. Biochem Biophys Acta. 1995,1269:98-104.

收稿: 1998-06-06修回:1999-01-23