关键词： 受体，血管紧张素；哺乳动物腺病毒属；血管内膜；基因疗法

【摘要】目的探讨腺病毒载体介导的大鼠反义血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ_B(AT_1B)RNA转移对大鼠颈动脉损伤后新生内膜的影响。方法利用重组腺病毒载体将大鼠反义AT_1B RNA转移至大鼠颈动脉球囊损伤模型中,21天后观察其对新生内膜形成的影响。结果用腺病毒载体转导大鼠反义AT_1B RNA至大鼠球囊损伤的颈动脉,与对照组相比,21天后损伤血管新生内膜/中层面积比降低了47%(P＜0.001)。结论反义AT_1B RNA对血管成形术后再狭窄可能有一定的预防作用。

Effects of adenoviral vector-mediated rat antisense AT_1B gene

transfer on neointima proliferation after rat carotid artery injury

OU YANG PingXU DingliHUANG Honglianet al.

Department of Cardiology, Nanfang Hospital, First Military Medical

University, PLA, Guangzhou 510515

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of rat angiotensin II receptor I_B (antisense AT_1B) gene transfer mediated by adenoviral vector on neointimal proliferation after rat carotid injury.MethodsAntisense (AT_1B) gene was transducted into the carotid artery by adenoviral vector after carotid balloon injury and the restenosis model was established in SD rat. Neointima/media area ratio in local artery at day 21 after gene transfer was measured.ResultsRat antisense AT_1B gene was succesfully transducted into the carotid artery after carotid balloon injury. Neointima/media area ratio was significantly reduced (47%, P＜0.01) compared with the control group at day 21 after gene transfer.ConclusionThe results suggest the possibility that antisense AT_1B gene transfer is a potential therapeutic approach to prevent neointimal hyperplasia.

【Key words】antisense AT_1Badenovirus vectorrestenosis neointima hyperplasiagene therapy

在动脉损伤后引起血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖中,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)一直是人们关注的因素。研究证明,AngⅡ能刺激体外培养的大鼠、兔和人的VSMC的增殖^［1］，表明AngⅡ是促进VSMC增殖的一种生长因子,在血管成形术后再狭窄的形成中有着重要的作用。AngⅡ的生物学效应必须通过与细胞膜上的特异性受体结合方能实现。血管紧张素受体根据它们的药理学特性分为两个独特的类型,分别称为Ⅰ型(AT₁)和Ⅱ型(AT₂)^［2］。目前已知AngⅡ的生理功能均由AT₁受体介导。在大鼠颈动脉球囊损伤后,在新生内膜细胞中AT₁受体的表达明显增加,说明AT₁受体在促进VSMC增殖中发挥着重要的作用^［3］。本研究利用AT₁受体的反义RNA来阻断VSMC中AT₁受体的表达,从基因治疗角度探索阻断AngⅡ对VSMC增殖作用的新方法。

材料与方法

一、材料

AdVE1CMVβgal重组腺病毒上清由美国University of Philadelphia的Dr. J M Wilson惠赠。反义AdVE1CMVAT_1B和正义AdVE1CMVAT_1B重组腺病毒上清由美国University of Colorado Health Science Center的Qingzhong Kong博士惠赠。293细胞由上海医科大学分子遗传研究室宋后燕教授惠赠。小鼠肝癌细胞株Hepa1-6由第二军医大学东方肝胆外科研究所钱其军博士后赠送。FBS、X-gal均购于GIBCO BRL公司。SD雄性大鼠由第一军医大学动物中心提供。2.0F PTCA球囊导管：Cordis公司。

二、方法

1.重组腺病毒载体(AdVE1CMVβgal、正义和反义AdVE1CMV/AT_1B)的扩增、病毒滴度的测定及βgal表达检测参照张维维创建的方法进行^［4］。

2.AdVE1CMVβgal体外转导小鼠肝癌细胞株Hepa1-6及βgal的检测：将6×10⁵小鼠肝癌细胞Hepa1-6接种于24孔板,加入经10倍稀释的AdVE1CMV βgal腺病毒液100μl,37℃、5%CO₂孵箱中孵育30min,而后加入含10%FBS的DMEM培养,转导后12小时、24小时、48小时分别检测βgal的表达。检测方法如下:弃培养液,加βgal固定液,4℃固定5min,弃固定液,加X-gal染色,37℃、5%CO₂孵箱中作用30min。镜下观察。

3.腺病毒载体介导的大鼠反义AngⅡ受体I_B基因转移至大鼠颈动脉损伤模型中:(1)实验分组:正常动脉组、AdVβgal组、正义AdVAT_1B组、反义AdVAT_1B组。(2)大鼠颈动脉球囊损伤动物模型的建立:取雄性SD大鼠，体重300～400克，腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，取颈部正中切口，从颈外静脉注射肝素钠100U/kg，寻找到左颈总动脉和颈外、颈内动脉分叉处，在左颈总动脉近心端暂时阻断血流，从颈外动脉处行动脉切开术，将2.0F PTCA球囊导管从切口插入至颈总动脉约1.5cm,以1.5atm充盈球囊，来回抽动3次以剥脱内膜。(3)in vivo重组腺病毒载体的基因转移:从4℃冰箱中取出上述三种重组腺病毒载体的病毒上清。动物模型建立后，将球囊导管顶端退至颈外动脉切口处，用缝线固定。从导管末端注射DMEM培养液以冲洗损伤节段的局部血管管腔。而后将50μl的反义AdVAT_1B病毒上清，或将正义AdVAT_1B病毒上清或AdVβgal病毒上清局部注射至损伤的血管节段内，使病毒上清在局部作用15min,结扎颈外动脉，而后去除显微血管夹，恢复血流，缝合颈部伤口。(4)取材和切片:术后3周，将SD大鼠腹腔注射过量的戊巴比妥钠,开胸后，剪开心尖部，从心脏插管，灌注生理盐水肝素液15min，再用10％福尔马林液灌注固定20min，取出损伤部位的左颈总动脉约1.0cm左右，经石蜡包埋后行病理切片，用HE染色，在光镜下观察血管内膜增生情况，每份标本非连续取4处切片。(5)测量内膜及中膜横断面的面积，计算内膜/中层面积比:利用Quantiment520型计算机图象分析仪分别测量血管内膜和中膜横断面的面积，以内弹力膜区别内膜和中膜，测量采用单盲法，测量者为与本实验无关者。

4.资料的统计分析:数据统计采用SPSS软件包,运用单因素ANVOA分析及Student-Newman-Keuls t检验。数据以均值±标准误表示。

结果

1.重组腺病毒载体(AdVE1CMVβgal、正义和反义AdVE1CMV/AT_1B)的扩增、病毒滴度的测定及βgal表达检测:293细胞是一种由人5型腺病毒DNA转化的原代人胚肾细胞的永久细胞株,其含有和表达Ad5的转化基因,对人类腺病毒高度敏感。293细胞为一单层融合的细胞,当腺病毒感染后,感染的293细胞出现特征性的细胞病效应(cytopathic effect , CPE),CPE是表明在感染细胞中腺病毒活性的形态学证据,CPE开始时通常是细胞变圆,细胞在培养皿开始剥脱悬浮,形成许多葡萄样的簇丛^［4］。利用293细胞成功地将三种重组腺病毒载体病毒进行了扩增,并利用空斑评价方法精确地对三种重组腺病毒上清的病毒滴度进行了测定,结果分别为AdVE1 CMVβgal:2.2×10⁹PFU/ml；反义AdVE1 CMVAT_1B:3.8×10⁹PFU/ml;正义AdVE1 CMVAT_1B:3.4×10⁹PFU/ml。用AdVE1 CMVβgal转导体外培养的小鼠肝癌细胞株,成功地检测到有明显的外源基因βgal的表达。

2.大鼠血管紧张素Ⅱ受体ⅠB基因转移对大鼠颈动脉损伤后新生内膜增殖的影响:动物转基因后，在饲养观察的过程中，除AdVβgal组有1例在术后8天死亡，正义AdVAT_1B组有1例在术后6天死亡外，其余全部存活至21天。大鼠颈动脉损伤21天后，在光镜下，可见AdVβgal组、正义AdVAT_1B损伤动脉血管新生内膜明显向管腔内增厚，造成管腔狭窄，反义AdVAT_1B组损伤动脉血管新生内膜增殖程度减轻。用图象分析仪分别测量正常动脉组(n＝6条动脉)、AdVβgal组(n＝5条动脉)、正义AdVAT_1B组(n＝5条动脉)、反义AdVAT_1B组(n＝6条动脉)的新生内膜和中膜面积，计算新生内膜与中膜的面积的比值，利用单因素方差分析和SNK法进行统计分析，结果表明，与AdVβgal组相比，反义AdVAT_1B基因组的动脉血管新生内膜/中层面积比降低了约47％(P＜0.001)。与正义AdVAT_1B组相比，反义AdVAT_1B基因组的动脉血管新生内膜/中层面积比降低了约44％(P＜0.001)(图1～3)。

图1SD大鼠颈动脉损伤后反义AT_1B受体基

因转移对血管内膜/中层面积比的影响

图2大鼠颈动脉损伤，用AdVE1CMVB gal腺病毒上清转导后21天，