关键词： 胰岛素；血红素氧化酶；一氧化碳

【摘要】目的观察胰岛素对Wistar鼠主动脉组织及体外培养主动脉平滑肌细胞基础和诱导状态血红素氧合酶（HO）活性的影响，探讨胰岛素与血红素氧合酶-一氧化碳系统（HO-CO）以及血管舒缩功能的关系。方法应用离体Wistar鼠主动脉组织孵育技术和主动脉平滑肌细胞培养技术，以胆红素生成量作为HO活性的指标，以培养上清液中碳氧血红蛋白(COHb)含量作为内源性一氧化碳(CO)产量的指标，从组织和细胞水平观察生理范围内不同浓度胰岛素对血管局部HO活性和内源性CO产生量的影响。结果（1）基础状态下，梯度浓度胰岛素40、80、160、320、640μU/ml使主动脉HO活性分别增高48.2%、60.8%、80.7%、70.5%、62.2%（P＜0.05或0.01），使主动脉平滑肌细胞培养上清液中COHb产量分别增加8.7%、18.6%、40.2%、17.4%、7.9%（P＜0.05或0.01）。（2）诱导状态下，胰岛素对主动脉组织HO活性及血管平滑肌细胞培养上清液中COHb产量均无影响。结论胰岛素对血管局部HO-CO系统的影响与HO-CO系统的状态有关；在基础状态下，胰岛素可引起血管局部HO活性增强，在生理范围内呈浓度依赖关系，过高浓度的胰岛素对HO活性作用反而减弱；但在诱导状态下，胰岛素对HO活性并无明显影响。

The effect of insulin on the heme oxygenase-carbon monoxide

system in the basal and induced state in normal rat aorta

CHENG YouqinCAO ShaojunWU Shanshanet al.

Beijing Military General Hospital, PLA, Beijing 100700

【Abstract】ObjectiveThe aim of this study was to investigate the effect of insulin on the heme oxygenase-carbon monoxide (HO-CO) system in its basal and induced state.Methods(1)Isolated Wistar rat aorta was cultured in the media containing different concentrations of insulin 40 μU/ml, 80 μU/ml, 160 μU/ml, 320 μU/ml, 640 μU/ml and add heme 10 μmol/L (basal state) or 40 μmol/L (induced state) for 24 hours. The relative activity of HO was measured with bilirubin (pmol/g/h). (2) The Wistar rat aortic smooth muscle cells were cultured in the solution containing insulin and heme (consistency same as above) for 24 hours too. The relative amounts of carbon monoxide released into the media were measured with the quantifying carbon monoxide hemoglobin (COHb).Results(1)The HO activities in the basal state were increased, by the insulin, 48.2%, 60.8%, 80.7%, 70.5% and 62.2%, respectively (P＜0.05 or ＜0.01). (2) The COHb in the culture solution of VSMCs were increased, by the insulin (concentrations as above), 8.7%, 18.6%, 40.2%, 17.1%, 7.9%, respectively (P＜0.05 or ＜0.01). (3) In the induced state HO activity was not effected by insulin.ConclusionsThis study suggests that insulin can increase aorta HO activity in the basal state but not in the induced state, and the effect of insulin on HO-CO system is related to the state of HO.

【Key words】insulinheme oxygenasecarbon monoxide

血红素-血红素氧合酶-一氧化碳-环磷酸鸟苷系统参与许多生理和病理生理过程。包括血管舒张、血压调控等^［1，2］。近年实验和临床研究发现高血压患者存在胰岛素抵抗和继发性高胰岛素血症^［3］。以往实验证实在基础状态下生理范围内胰岛素可增强血管局部血红素氧合酶-一氧化碳系统（HO-CO）功能，但高浓度胰岛素对不同状态HO活性的影响尚不清楚。本实验观察不同浓度胰岛素对基础状态离体Wistar鼠主动脉HO活性及体外培养血管平滑肌细胞HO-CO的影响，以便进一步探讨高血压时继发性高胰岛素血症与高血压发生发展的关系。

材料与方法

1.雄性Wistar鼠，6周龄，体重80～100克。胎牛血清(FBS)，为浙江金华犊牛再利用研究所产品；DMEM1640培养液、氯血红素、牛血红蛋白(Hb)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-P-D)、辅酶Ⅱ(NADP)等购自Sigma公司。胰岛素为天津第二生化制药厂产品。其他试剂系进口或国产分析纯试剂。

2.主动脉组织HO活性测定：动物断颈处死，无菌条件速取同等长度主动脉(包括胸、腹主动脉)；用含10%FBS的1640液洗净残血。主动脉沿纵轴剪开，去除内皮，剪碎，置含10%FBS的1640培养液的12孔培养板(每孔1条血管)，在含CO₂的培养箱中平衡1小时，弃液，加入上述培养液，并按实验分组(每组6条血管)不加或加入不同浓度胰岛素40、80、160、320、640μU/ml，同时加入氯血红素10μmmol/L作为HO的底物或40μmmol/L诱导HO，使其处在诱导状态。二氧化碳培养箱37℃孵育24小时。实验结束，参照Mahin等^［4］的方法，将血管条加入200mmol/L磷酸缓冲液3ml，在冰水浴中作组织匀浆，4℃18800g离心10分钟，取上清，4℃100000g再离心60分钟，将沉淀的微粒体部分混悬在100mmol/L磷酸钾缓冲液中。此前参照Tenhunent等^［5］的方法从鼠肝中粗提纯胆绿素还原酶备用。用Yoshida等^［6］的方法分析HO的活性：终容积2ml的反应混合液中含有100μmol磷酸钾，胆绿素还原酶1mg，G-6-P-D0.2单位，NADP0.8mmol/L，G-6-P1mmol/L，2.5mmol/L的氯血红素20μl，1ml鼠主动脉微粒体部分，反应进行60分钟，将试管放入冰水中终止反应。孵育后的混合液用721分光光度仪测定，所形成的胆红素量以在464和530nm吸收率的不同来确定，应用40mmol^．L^-1．cm^-1的消光系数计算，并校正重量。微粒体制剂及粗提纯胆绿素还原酶制剂中的蛋白浓度用紫外分光光度法测定，计算公式：蛋白浓度C(mg/ml)=1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀。

3.主动脉平滑肌细胞培养上清中COHb测定:动物断颈处死，无菌条件速取主动脉，贴块法行主动脉平滑肌细胞培养。实验采用6～8代细胞。制备6×10⁴细胞/ml悬液，接种于24孔板，每孔1ml，含20%FBS的1640培养液孵育48小时，换1%FBS的1640液孵育24小时，弃原液，每孔加10%FBS的1640培养液1ml，并按以下实验分组(每组6孔)分别加入试剂：空白对照组；胰岛素实验1～5组分别加入不同浓度胰岛素40、80、160、320、640μU/ml。基础状态对照组及实验组均加入氯血红素10μmol/L作为底物；诱导状态对照组及实验组均加入氯血红素40μmol/L作为诱导物。孵育24小时，实验结束前1小时加入牛Hb50μmol/L，实验结束取培养上清液在GD3022型酶标测定仪570nm检测COHb消光数。

4.统计处理，胆红素以均数±标准差表示，组间比较用SNK检验；COHb以对照组为100%用相对数表示，组间比较用SNK检验。P＜0.05或＜0.01为差异有显著意义或非常显著意义的界值。

结果

1.胰岛素浓度与不同状态HO活性的关系(图1)：基础状态下，梯度浓度胰岛素使HO活性增高，在160μU/ml以下呈浓度依赖关系，继续增高浓度，HO活性不在增高，反而下降。诱导状态下无明显影响。

图1胰岛素对Wistar鼠主动脉组织基础和诱导状态血红素氧合酶活性影响

(注：A组=胰岛素40μU/ml，B组=胰岛素80μU/ml，C组=胰岛素160μU/ml，

D组=胰岛素320μU/ml，E组=胰岛素640μU/ml；基础状态组间比较，

^*P＜0.05，^**P＜0.01；图2同此)

2.胰岛素浓度与主动脉平滑肌细胞培养上清中COHb生成量的关系(图2):基础状态下，COHb产量与胰岛素浓度呈钟形曲线关系，峰值在160μU/ml。诱导状态下无明显影响。

图2胰岛素对基础及诱导状态Wistar鼠主动脉平滑肌细胞

培养上清液中COH_b含量的影响

讨论

高血压病时的胰岛素抵抗和继发性高胰岛素血症近年已引起广泛关注。已有实验揭示在胰岛素的血管作用中，涉及L-精氨酸-一氧化氮系统的激活^［7］。

血管局部血红素-HO-CO系统与L-精氨酸-一氧化氮系统关系密切，HO的功能状态与高血压病的关系近年开始引起重视。我们既往实验证实生理范围胰岛素可增强血管局部血红素-HO-CO系统的活性，并呈浓度依赖方式。本实验中，我们将胰岛素浓度增加，直至640μU/ml，远远超出生理水平，结果在基础状态下，过高浓度胰岛素并未使HO的活性及内源性CO的产生量继续增高，反而下降。本实验还观察到，在用氯血红素诱导状态下，与基础状态同样浓度的胰岛素对HO的活性及CO产生量并无明显影响。因此，胰岛素对血管局部HO-CO系统的影响除其本身的浓度外，还与HO-CO系统的状态有关。已有实验证实，血<