关键词： 脂蛋白(a)；动脉粥样硬化；纤溶酶原激活物抑制物1

【摘要】目的研究脂蛋白(a)是否能刺激肝细胞纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）的分泌。方法将不同浓度的脂蛋白(a)加到培养的HepG₂细胞，应用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术测定细胞上清液中的PAI-1抗原，采用逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)观测HepG₂细胞中PAI-1 mRNA的表达。结果脂蛋白(a)能刺激HepG₂细胞PAI-1抗原的分泌并具剂量效应关系，同时PAI-1mRNA表达增加。结论脂蛋白(a)能刺激肝细胞PAI-1基因表达，脂蛋白(a)的这种作用可能参与了其致动脉粥样硬化的病理过程。

Role of lipoprotein(a) on secretion of plasminogen activator inhibitor type 1 in HepG₂ cells

WU Chunfang^*, CHEN Lianghua, LU Guoping, et al. ^* Department of Cardiology, Affiliated Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025

【Abstract】ObjectiveTo examine whether lipoprotein (α) can stimulate the secretion of plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) in cultured hepatic cell.MethodsDifferent concentrations of lipoprotein (α) were added to cultured HepG₂ cells. PAI-1 antigen in the supernatant was measured by ELISA while PAI- 1 mRNA expression assessed through reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique.ResultsLipoprotein (α) stimulated the secretion of PAI-1 antigen by HepG₂ cells with a dose-effect relation and enhanced PAI-1 mRNA expression simultaneously.ConclusionLipoprotein (α) can stimulate PAI- 1 gene expression in cultured hepatic cells and this effect may be involved in atherogenesis.

【Key words】lipoprotein (α)atherosclerosisplasminogen activator inhibitor 1

血浆脂蛋白(a)［lipoprotein(a),Lp(a)］水平的增高是动脉粥样硬化的危险因素。Lp(a)与纤溶酶原(plasminogen)具有高度同源性，因而能抑制纤溶酶原与纤维蛋白(原)的结合，干扰了内源性纤溶功能，可能是Lp(a)致动脉粥样硬化的重要机制^［1］。 有研究表明Lp(a)能够刺激人血管内皮细胞纤溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor type 1,PAI-1)的分泌^［2］。 事实上，除血管内皮细胞外，肝细胞也是PAI-1的重要来源^［3］。本研究观察了Lp(a)对HepG₂细胞PAI-1基因表达的影响。HepG₂细胞是一人肝肿瘤细胞系，就激动剂与拮抗剂对PAI-1分泌的影响来说能模拟体内肝细胞^［4］。

材料与方法

一、材料

HepG₂细胞由上海市内分泌研究所提供，Lp(a)由Sigma提供，TRI_ZOL抽提试剂盒、DMEM由GIBCO_BRL提供，PAI-1抗原测定试剂盒购自DIAGNOSTICA STAGO，各种RT-PCR试剂购自华美生物技术公司。PAI-1引物由中国科学院上海细胞生物研究所从cDNA文库设计并合成，上游：5′CC-ACTTCTTCAGGCTGTTCCG3′，下游：5,GTCGGTCATT-CCCAGGTTCTCAGG3′，扩增片段559 bp，β-actin引物序列据文献报道^［5］而合成，上游：5′AAGGATTCCT-ATGTGGGC3′，下游：5′CATCTCTTGCTCGAAGTC3′，扩增片段532 bp。

二、方法

1.HepG₂细胞培养：HepG₂细胞在培养瓶中用DMEM(辅以10%小牛血清)进行培养，细胞融合成致密单层后在无血清DMEM中至少培养6 h，然后以PBS洗3次，再在无血清DMEM中培养，进行各种条件刺激，即以Lp(a)终浓度10 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml加入DMEM中培育16 h，各种条件刺激完成后，收集培养液并离心除去细胞碎片进行PAI-1抗原测定，HepG₂细胞则用胰蛋白酶消化，离心保存于-70℃留做PAI-1 mRNA分析。每种条件刺激均培养5瓶细胞。

2. PAI-1抗原测定：参照试剂盒说明书，用ELISA方法测定PAI-1抗原。

3. HepG₂细胞总RNA抽提及RT-PCR反应：应用TRI_ZOL试剂抽提HepG₂细胞总RNA，采用紫外分光光度计测定其浓度。取2 μg总RNA进行RT反应，RT体系20 μl含2 μg总RNA、随机引物100 ng、RNAsin 40 U、M-MLV逆转录酶200 U、NTP 1 mmol，每一标本取RT产物各5μl进行PAI-1与β-actin的PCR反应。PCR反应体系含相应上、下游引物30 pmol、Taq酶2 U。两者反应条件相同：94 ℃ 1 min,50 ℃1 min, 72℃ 1 min，首次循环94 ℃3 min，共30个循环，结束前72 ℃10 min。各取PCR产物10 μl，经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色、照相并经光密度仪扫描分析，以β-actin光密度值进行标准校正，计算PAI-1产物的相对量。计算公式：PAI-1相对量=PAI-1产物电泳条带密度/β-actin产物电泳条带密度。

三、统计学处理方法

各项数据均以+s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有显著性。

结果

1. PAI-1抗原的改变：HepG₂细胞在无血清DMEM中培养16 h后，上清液中PAI-1抗原释放(13.5±1.5) ng/ml，是为基础PAI-1分泌，而不同浓度的Lp(a)加入DMEM中可见PAI-1抗原含量升高，Lp(a)10、25、50、100 μg蛋白/ml引起PAI-1抗原分泌分别为(30.4±3.5) ng/ml、(45.6±2.9) ng/ml、(57.9±3.1) ng/ml、(60.2±4. 1) ng/ml，与基础PAI-1分泌相比显著增加(P均＞0.01)，且呈剂量效应关系，但Lp(a) 50 μg蛋白/ml与100 μg蛋白/ml引起的PAI-1分泌增加则没有统计学差异。

2. PAI-1 mRNA改变：所有PAI-1及β-actin的扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，所示条带分别为559 bp和532 bp，符合设计的片段大小（图1）。PAI-1 mRNA相对量基础状态为0.242±0.021，而加入Lp(a) 10、25、50、100 μg蛋白/ml则分别为0.586±0.033、0.914±0.036、1.108±0.026、1.072±0.031，与基础状态比较差异有显著性(P均＜0.01)，且具有量效关系，符合PAI-1抗原分泌的变化（图2）。

图1PAI-1与β-actin RT-PCR扩增结果

（M=PCR marker;A～C=β-actin扩增片段,532 bp；D～F=PAI-1扩增片段，559 bp）

图2Lp(a)对HepG₂细胞中PAI-mRNA表达的影响

［M=PCR marker；A、B、C、D、E分别为Lp(a)浓度0、10、25、50、100 μg/ml时］

讨论

Lp(a)是由一个LDL颗粒通过二硫键与载脂蛋白A(apo A)结合而成的，由于apo A与纤溶酶原具有结构上的同源性，可抑制纤溶酶原与血管内皮细胞结合并干扰纤溶酶的形成从而影响纤溶通路而具有促血栓形成效应。Lp(a)水平增高(＞25～30 mg/dl)可能亦是重要的心血管危险因素^［6］。1991年Etingin等^［2］首次发现体外能刺激人内皮细胞PAI-1抗原分泌及mRNA的表达。PAI-1是tPA及uPA主要的生理抑制剂，血浆PAI-1通过tPA/PAI-1相互作用负责调节整个纤溶过程^［7］，越来越多的研究表明PAI-1水平的升高可能也是动脉粥样硬化的危险因素，Juhan-Vague等^［8］建议将PAI-1水平的升高作为X-综合征(胰岛素抵抗综合征)成员之一，以强调其在动脉粥样硬化形成中的作用。

血浆PAI-1的来源主要有三个方面：血管内皮细胞、肝细胞及血小板，但何者占优，目前尚不明确。体外影响PAI-1分泌的因素有多种，除Lp(a)外，极低密度脂蛋白可刺激血管内皮细胞及HepG₂细胞分泌PAI-1，某些细胞因子(如白介素-1、肿瘤坏死因子)与生长因子(如血小板源性生长因子、转化生长因子-β等)也可刺激PAI-1的分泌，且认为是在转录水平上进行调节^［8］。本研究表明,Lp(a)体外也能刺激肝细胞PAI-1抗原分泌及mRNA表达，但究其作用机理，如是否通过肝细胞上apo B、E受体尚不清楚，且在体内情形如何，仍需进一步研究。

Lp(a)致动脉粥样硬化的机制较为复杂，除熟知的竞争抑制纤溶酶原外，象低密度脂蛋白一样也可被氧化修饰而具致动脉粥样硬化的作用及致血栓性。本研究及其他研究还表明，Lp(a)可能通过刺激血管内皮细胞和肝细胞PAI-1分泌而间接发挥其致动脉粥样硬化作用。

参考文献

1Rees A. Lipoprotein(a):a potential link between lipoprotein metabolism and thrombosis. Br Heart J, 1991,65:2-3.

2Etingin OR, Hajiar DP, Hajiar KA, et al. Lipoprotein(a) regulates plasminogen activator inhibitor 1 expression in endothelia