关键词： 信号传递；小鼠，基因摧毁；受体，血管紧张素

【摘要】目的研究敲除血管紧张素Ⅱ受体亚型（AT_1a）基因对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）信号传导的影响，明确AT_1a在血管功能调节中的作用。方法应用缺乏AT_1a基因小鼠的主动脉血管平滑肌细胞（VSMC），采用钙荧光分析技术，观察G蛋白受体偶联和酪氨酸激酶相关的钙离子信号传导通路的变化。结果敲除AT_1a基因，并不影响AngⅡ介导的VSMC钙增加，应用G蛋白拮抗剂和酪氨酸激酶抑制剂均能显著抑制AngⅡ反应。结论敲除AT_1a基因，其他AT₁受体亚型能起明显的代偿作用，AT_1a受体亚型受G蛋白和酪氨酸激酶信号传导通路共同调节。

Effect of angiotensin II receptor subtype (AT_la) knockout on angiotensin II mediated calcium signal transduction pathways ZHU Zhiming, ZHU Shanjun, HU Houxiang. Hypertension Center, Daping Hospital, Third Military Medical University, PLA, Chongqing 400042

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of AT_la gene knockout on angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) mediated calcium signal transduction pathways and determine the role of AT_la gene in the regulation of vascular function.MethodsVascular smooth muscle cells (VSMCs) were obtained from mice that mutant AT_la gene and its wild type control. Intracellular calcium signal was observed using Fura-2/AM fluorescent technique. GDP-βS and genestein were used to antagonize G-protein and tyrosine kinase (TK) coupling pathways, respectively.ResultsAng Ⅱ mediated calcium signal was ineffective after knockout AT_1a gene. Inhibition of G-protein and TK can significantly reduce the response of calcium signal to Ang Ⅱ stimulation in VSMCs from mice.ConclusionCalcium signal was not interrupted by AT_1a gene knockout due to compensative effect of other AT₁ receptor subtype and AT₁ receptor subtypes were regulated by both G-protein and TK coupling signal transduction pathways.

【Key words】signal transductionmice, knockoutreceptors, angiotensin

血管紧张素Ⅱ( Ang Ⅱ）在高血压发病中起重要作用, AngⅡ主要与其特异性受体(AT₁）结合,通过G蛋白偶联的磷脂酶C(β)和酪氨酸激酶相关的磷脂酶C(γ)信号通路导致细胞内第二信使分子改变,并介导一系列级联反应,使血管张力增高和心血管细胞重塑^［1］。AT₁分为二个亚型：AT_1a和AT_1b。大量研究证实，AngⅡ发挥作用主要通过AT_1a, 应用特异性AT_1a拮抗剂能有效地降低血压及逆转心血管细胞重塑^［2］。因此, AT_1a基因是重要的高血压相关基因。虽然AT_1a在血压及血管结构功能调节中的作用已获充分肯定, 但很难确定AT_1a这种作用是只源于AT_1a基因的本身, 还是与其他的相关基因共同作用或协同作用的结果？ 剔除AT_1a基因是否能充分阻断AngⅡ所致的增压反应及血管细胞重塑?常规的研究手段很难回答上述问题。近年来，建立的基因敲除或打靶（gene knockout or gene targeting）技术为研究目的基因的体内功能和相关疾病的致病机制提供了有利手段^［3］。本研究应用敲除AT_1a基因的血管平滑肌细胞（VSMC），观察敲除AT_1a基因对AngⅡ的信号传导通路有什么影响，进一步明确AT_1a在血管功能调节中的作用。

资料与方法

1．血管平滑肌细胞培养及基因型分析：AT_1a基因敲除小鼠及野生对照型小鼠的主动脉VSMC，由美国北卡大学病理系Sonny H Zhang博士提供，方法简述如下：分离小鼠主动脉，去除血管内皮及结缔组织后，将中层血管平滑肌切成1 mm²小组织块作贴壁培养，获得原代细胞后，再传代培养，培养的VSMC经免疫组化和形态学观察证实，本研究所用细胞为6代以内。按文献报道^［4，5］，分析细胞基因型和基因表达，采用Southern blot及RT-PCR方法。细胞DNA经限制性内切酶HindⅢ切割及应用特异性DNA探针，AT_1a基因敲除细胞（AT_1a-）产生一5.0 kb的条带，而野生对照细胞（WT）产生一3.3kb的条带，RT-PCR显示AT_1a- 无AT_1amRNA表达，而AT_1bmRNA表达明显增强，而在WT，AT_1bmRNA和AT_1amRNA同时表达。

2. 钙信号传导通路的研究： 应用荧光双波长倒置显微镜系统（PTI104B），将培养的VSMC经Fura-2/AM染色后，按文献［6］的方法观察细胞内钙信号的变化，实验中应用GTP-βs拮抗G蛋白及Genestein特异性地抑制酪氨酸激酶，AngⅡ用于刺激细胞内钙，细胞钙浓度单位为nmol/L。

3. 统计学分析：数据以±表示, t检验，P＜0.05为有统计意义。

结果

1.对照组VSMC基础钙浓度，AT_1a- 为（102±8） nmol/L，WT为（90±6） nmol/L，予100 nmol/L AngⅡ刺激后VSMC钙净增值（ΔCa²⁺），在AT_1a-为 (308±27) nmol/L (n=28），WT为（254±21） nmol/L,(n=30)，AT_1a(-)钙的基础值及ΔCa²⁺与WT相比差异无显著性（P＞0.05）。

2. VSMC与100 μmol/L G蛋白拮抗剂GDP-βs作用30分钟，VSMC的钙基础值，AT_1a- 为（88±8） nmol/L (n=17)，WT为（74±4） nmol/L (n=8)，分别与对照组的钙基础值相比差异无显著性(P＞0.05）。VSMC经与GDP-βs作用后，AngⅡ刺激所致的ΔCa²⁺较对照组明显下降（P＜0.01），AT_1a- 为（55±8）nmol/L（n=17），WT为（56±15） nmol/L (n=8)（图1）。

图1GDP-βs对AngⅡ的作用

3.VSMC与特异性酪氨酸激酶抑制剂Genestein（100 ng/mL）作用30分钟，VSMC的钙基础值在AT_1a(-) 和WT分别为（121±8） nmol/L (n=19)及（103±7） nmol/L（n=15），两者与对照组钙基础值相比差异无显著性(P＞0.05)。Genestein能显著抑制AngⅡ诱导的钙增加，ΔCa²⁺在AT_1a-及WT分别为（70±17） nmol/L (n=19)和（90±22） nmol/L (n=15)，与对照组相比，P＜0.01（图2）。

图2Genestein对AngⅡ的作用

讨论

目前，研究疾病的致病或相关基因主要通过两种策略：一为根据表型或性状的变化研究导致表型和性状变化的相关或侯选基因；另一为依据特异基因的变化研究相关的表型改变^［7］。基因敲除的主要思路是通过改造致病基因或相关基因来研究该基因的体内功能及其在疾病发生中的作用。

高血压病主要以外周阻力血管增生肥厚及张力增高为特征，AngⅡ又是主要的缩血管物质和致血管重构的重要因素。AngⅡ调节血管结构及功能的主要过程是与其特异的G蛋白偶联的受体（AT_1a）结合，激活PLC-β，产生二种重要的第二信使分子，三磷酸肌醇（IP₃）和甘油二脂（DAG），导致细胞内钙释放和蛋白激酶C激活，并对包括转录因子在内的多种底物进行磷酸化调节，发挥生物学效应^［8］。最近发现，AngⅡ与AT₁受体结合后，还可激活可溶性酪氨酸激酶PP60，然后磷酸化和刺激PLC-γ₁，PLC-γ₁进一步水解磷酯酰肌醇，最终生成IP₃和DAG。IP₃致细胞内钙释放，细胞内钙增加又可激活低电导的氯通道，使膜去极化激活钙通道，致钙内流增加^［9，10］。

AngⅡ的上述效应主要是通过AT_1a介导的。因此,AT_1a是AngⅡ发挥作用的关键靶分子，从机理上分析敲除AT_1a基因应能充分阻断AngⅡ的信号传导及生物学效应。根据Coffman等^［5］报道, 敲除AT_1a基因的小鼠对外源性AngⅡ的增压反应虽有明显降低,但并不能完全消除。作者曾进一步与Coffman合作探讨敲除AT_1a基因导致的AngⅡ增压反应下降是否与消除AT_1a介导的钙信号传导有关,但结果与我们预期相反。我们观察到敲除AT_1a基因后,AT_1b的mRNA表达明显增加,AngⅡ仍可导致缺乏AT_1a基因的VSMC钙升高,而这种细胞钙增加主要通过受体介导的钙内流和细胞内钙释放两种途径。应用AT₁受体拮抗剂Losa