为了探讨高血压时血管平滑肌细胞(artery smooth muscle cells, ASMC)的病理特征，我们用胰岛素对高血压病人的ASMC和正常血压人的ASMC干预后，观察胰岛素刺激后ASMC的增殖情况和c-fos表达量的变化。

一、材料与方法

1.高血压病人及正常人的动脉血管平滑肌取自腹部手术的肠系膜动脉。DMEM培养基为美国GIBCO产品。小牛血清系华西医科大学分子生物学教研室产品。培养用胰岛素、胶原酶A和DEPC为美国sigma公司产品，硝酸纤维素膜系Amersham公司产品。Guanidinium thiocyanate为美国Fluka公司产品。地高辛标记Kit，限制性内切酶pStI系德国Boechringer Mannheim公司产品。质粒PFBJ-3由第三军医大学组胚教研室吴康副教授惠赠。

2.血管平滑肌细胞原代及传代培养：按以前所述方法进行^［1］。在无菌条件下，取肠系膜动脉，以胶原酶消化法，进行原代培养。以20%小牛血清DMEM培养基每周换液2次，待细胞长满瓶壁后，进行传代培养。实验所用ASMC为第4～8代。

3.胰岛素对ASMC的干预培养：将观察组分为胰岛素高血压组、胰岛素正常血压组，空白对照组进行ASMC培养，试验细胞取自第4～8代细胞，具体是将细胞消化分离后制备成悬液并进行计数。以2.5×10⁴细胞数接种于三块培养板，每个小组接种9个培养孔，其中胰岛素组加入培养用胰岛素，置37℃含5% CO₂培养箱内培养，每3天更换1次培养液。细胞计数在接种后第3、6、9天进行，每次细胞计数时随机取一块培养板，各小组分别从3个培养孔进行消化计数，各孔细胞连续计数3次，取其均值。

4.ASMC总RNA的提取：将各组未加胰岛素培养板指数生长期的ASMC换成无小牛血清的DMEM培养基，24小时换2次，使细胞生长处于静止期，在加入10%小牛血清的DMEM培养的0，30，45，60分钟，采用一步法提取ASMC细胞RNA，提取步骤见文献［2］。胰岛素干预后的ASMC总RNA的提取：将胰岛素高血压组、胰岛素正常血压组和空白对照组的ASMC以5×10⁴/每孔细胞数接种于24孔培养板中，37℃培养12小时后，每孔加入胰岛素100mμ，继续培养24小时后，同样采用一步法提取ASMC的RNA。

5.RNA斑点印迹杂交：质粒PFBJ-3经限制性内切酶pStI酶切后，回收980bp的c-fos cDNA片段，然后用随机引物标记法进行c-fos探针标记，按地高辛kit操作说明完成。RNA斑点印迹杂交按地高辛Kit说明进行。膜干燥后用GS-670型光密度仪(BIO-RAD)在400nm下扫描，斑点所对应的峰下面积表示c-fos含量，数据由仪器计算机直接给予。统计处理：应用计算机POMS医学统计系统，主要采用两样本均数t检验，数据用x±s表示。

二、结果

1.胰岛素对ASMC增殖的影响：采用不同的胰岛素浓度，可见胰岛素高血压组及胰岛素正常血压组的ASMC细胞数明显较空白对照组增加。

2.ASMC中c-fos mRNA表达的比较：c-fos的RNA杂交斑点的扫描光密度值经校正后，在ASMC生长静止期的基础状态下(无血清培养48小时)。正常血压组的ASMC c-fos基因表达低于高血压组的ASMC；在10%小牛血清刺激下，正常血压组和胰岛素高血压组的c-fos基因表达均迅速增强，于30分钟达高峰，随后正常血压组迅速下降，于45分钟时接近正常，而高血压组表达增强持续时间明显大于正常血压组。但两组差异无显著性。

3.胰岛素对ASMC中c-fos表达量的影响：胰岛素干预后，胰岛素正常血压组和胰岛素高血压组ASMC细胞中c-fos表达量均增加，而胰岛素高血压组ASMC中的c-fos基因表达量明显高于胰岛素正常血压组。

三、讨论

用体外培养人的ASMC研究表明，胰岛素可促进ASMC增殖DNA合成。我们对高血压病人和正常人的ASMC加胰岛素干预后，发现胰岛素高血压组ASMC细胞数增高，比胰岛素正常血压组ASMC明显(P＜0.05)。一些研究发现，在自发性高血压大鼠在血压升高前已有细胞生长速率增快，本研究显示胰岛素高血压组的ASMC细胞数比胰岛素正常血压组高。说明ASMC的异常增殖对高血压的发生有着重要意义。

本研究用的是高血压病人及正常人的ASMC，实验结果显示，在同样的小牛血清刺激下，胰岛素高血压组的ASMC的c-fos原癌基因的表达明显地大于胰岛素正常血压组，这提示原癌基因的表达异常可能与高血压病人组的ASMC的过度增殖有关。本实验用胰岛素对高血压病人和正常人的ASMC干预培养，结果显示，两组的ASMC加入胰岛素后，原癌基因c-fos的表达量明显高于空白对照组，并且胰岛素高血压组原癌基因c-fos的表达量明显高于胰岛素正常血压组。结果提示，ASMC的过度增殖与高血压病人ASMC中c-fos异常表达有关。但胰岛素是通过什么环节增加c-fos表达量，其机制有待进一步探讨。

参考文献

1王旭开.复合胶原酶法分离人血管平滑肌细胞的新方法.第三军医大学学报，1993，15：357-360.

2Chomezynsiki P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry, 1987, 162:156-159.

本课题为国家自然科学基金资助项目(NO：39370312)

(收稿：1997-07-31修回：1998-02-05)