关键词： 细胞外基质；纤连蛋白类；血管成形术，气囊

【摘要】目的探讨细胞外基质在血管成形术后再狭窄中的作用。方法在大鼠胸主动脉球囊损伤模型上，应用免疫组化和原位杂交的方法，观察纤连蛋白(Fn)在损伤后不同时间点和位置的蛋白和mRNA的表达。结果Fn在球囊损伤后第3天开始表达，第7天进一步增加，14天达高峰，30天仍持续高表达，在新生内膜及近内膜的中层最为明显。结论Fn在球囊损伤后异常增加，为新生内膜形成的重要原因，可能在成形术后再狭窄形成中起重要作用。

Variation of fibronectin after balloon angioplasty in the rat thoracic aortaWu Yongquan¹, Wang Lihui, Hu Dayi², et al. 1. Department of Cardiology, First Teaching Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034; 2. Beijing Redcross Chaoyang Hospital, Beijing 100020

【Abstract】ObjectiveTo investigate the function of extracellular matrix (ECM) on restenosis after balloon angioplasty. MethodsThe time and spatial course of mRNA and protein expression of fibronectin were exa-mined on the model of balloon angioplasty of the thoracic aorta in the rat with the combination of in situ hybridization and immunohistochemistry methods. ResultsThe expression of fibronectin began at the third day after balloon injury and continued to increase at the seventh day, and reached the maximum from two weeks to one month after injury, which was most significance on the medial near basement membrance and neointima. ConclusionThe variation of fibronectin may play a very improtant role in the migration of vascular smouth muscle cells, formation of neointima and restenosis after balloon angioplasty.

【Key words】extracellular matrixfibronectinsangioplasty, balloon

近年来，研究发现经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后细胞外基质(extracellular matrix, ECM)大量合成和积累，在再狭窄过程中起重要作用^［1］。纤连蛋白(fibronectin,Fn)是一种重要的细胞外基质成份、在组织的分化、胚胎的发育及组织损伤后的修复过程中起重要作用^［2］。为此，我们在大鼠胸主动脉球囊损伤模型上，观察Fn的动态变化过程，以探索其在再狭窄形成中的作用。

材料与方法

1.动物：40只雄性Wistar大鼠，重350 g左右，购自北京医科大学动物室。

2.动物模型的制备：40只大鼠随机分成5组(n=8)，正常对照8只，32只用5%戊巴比妥钠0.3 ml腹腔注射麻醉。由颈部分离左颈总动脉，用改良的2F Forgarty球囊导管从左颈总动脉插入胸主动脉至膈肌，以0.5～1.0 ml生理盐水充盈球囊至直径0.5～0.7 cm，反复回拉导管9次，拔出球囊，缝合伤口，常规饲养。分别于术后3、7、14、30天四组取材，每组8只，4%多聚甲醛原位固定15分钟，取出中间段胸主动脉大约4 cm，再用4%多聚甲醛继续固定2小时，30%蔗糖PBS(pH 7.2)液4℃过夜，DCT包埋，液氮冻存。连续冰冻切片(10 μm)，4%多聚甲醛固定切片5 mm，切片密封于有干燥剂的盒内，-70℃保存备用。

3.探针的制备：PFH₁质粒扩增、纯化参照《分子克隆》方法^［3］，纯化后的质粒用HindⅢ酶切，得到1 kb左右片段，用地高辛标记试剂盒(Boehringer公司)标记探针。

4.原位杂交：参照苏慧慈^［4］的《原位杂交》法，杂交前步骤：冰冻切片从-70℃取出，放至室温，10 μg/ml蛋白酶K 37℃孵育30分钟，用DEPC处理的PBS(pH 7.2)洗10分钟×3次，新配制的0.25%乙酰酐三乙醇胺洗10分钟，2×SSC洗5 min×2次，梯度酒精脱水各2 min，凉干，加预杂交液42 ℃孵育2小时。杂交反应：DNA探针97℃变性15分钟，放置冰上5分钟，按1 μg/ml浓度加入预杂交液配成杂交液，倾去玻片上的预杂交液，加入杂交液，42℃孵育4～6小时。杂交后反应：倾去杂交液，2×SSC洗5分钟×4次，0.1×SSC 42℃洗30分钟×2次，入buf-fer 1室温振摇2分钟，buffer 2室温振摇2分钟，擦去周围缓冲液，加用buffer 2稀释的抗地高辛抗体(1∶500)，室温孵育2小时，入buffer 1室温洗15分钟×2次，buffer 3室温3分钟，擦去周围缓冲液，加(NBT/Bcip)显色，室温显色2～12小时，随时镜下观察，出现紫红或蓝紫色阳性信号。

5.免疫组化：参照ZYMED公司的SP_TM试剂盒的Modified SP法：冰冻切片放至室温，3%过氧化氢孵育5分钟，0.05%胰酶37℃孵育10分钟，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，1%正常山羊血清(PBS稀释)室温封闭10分钟，倾去血清，加入1∶200兔抗鼠-抗4℃过夜，PBS冲洗5分钟×3次，滴加生物素标记的二抗(1% BSA-PBS稀释成1∶300)37℃孵育1小时，PBS冲洗5分钟×3次，辣根过氧化物酶标记的链霉卵蛋白素(PBS稀释成1∶300)37℃孵育1小时，PBS冲洗5分钟×3次，，DAB显色，苏木精复染，脱水，树胶封固。

结果

1.原位杂交：正常对照组：中层和外膜均未见Fn表达；术后第3天组：Fn在中层平滑肌细胞开始表达，并主要集中在近管腔的内弹力层附近；第7天组：Fn表达进一步增加，且主要集中在近内膜中层部位；第14天组：有明显新生内膜形成，中层和内膜的Fn mRNA表达强阳性，以新生内膜最为明显；第30天组：新生内膜进一步增厚，mRNA持续表达强阳性；未加探针组：示背影清晰，未见明显非特异着色。

2.免疫组化(附图)：正常组呈阴性反应(G)；第3天组(H)：近内膜部位有一层阳性显色；第7天组(I)：中层平滑肌细胞阳性结果进一步增加；第14天组(J)：有新生内膜形成，且内膜呈强阳性显色；30天组(K)：内膜进一步增厚且持续表达强阳性。

附图大鼠胸主动脉冰冻切片免疫组化结果(×200)

讨论

目前认为损伤后的过度修复是PTCA术后再狭窄的关键。内膜损伤后，一系列因子异常表达、激活，平滑肌细胞的表型发生改变，从收缩型(成年型)向合成型(胚胎型)转化，平滑肌细胞开始大量增殖、迁移并合成大量的细胞外基质，使内膜增厚、管腔狭窄^［5］。在此过程中，细胞外基质起着不容忽视的作用。纤连蛋白是一种重要的细胞外基质，在组织分化、胚胎发育中起重要作用，胚胎时期高表达，成年动物低表达，但损伤后代偿性增加。在成年大鼠血管，Fn无明显表达。当血管内膜损伤后，Fn代偿性合成和分泌，参与再狭窄的过程。本研究发现，损伤后3天中层平滑肌开始表达，第7天进一步增加，且主要集中在近内膜的基底膜部位，与文献报道的平滑肌细胞从第3天到第7天开始大量增殖与迁移相吻合^［6，7］，说明Fn表达可能与平滑肌细胞的增殖并由中层向内膜迁移有关。本实验室在体外培养平滑肌细胞实验发现，纤连蛋白能促进平滑肌细胞的增殖与迁移，从另外一个侧面证实这一点。第14天可见明显内膜增生，中层和内膜均有明显Fn表达，以新生内膜为主；30天新生内膜进一步增加，并持续表达强阳性，这说明纤连蛋白是形成新生内膜的重要成份。本研究对纤连蛋白的mRNA及蛋白表达作了动态观察，发现Fn在损伤后异常改变，并探讨了其在PTCA术后再狭窄发病机理中的可能作用。

本课题由国家教委博士点基金资助(No: 96024014)

参考文献

1Casscells W, Engler D, Willerson J. T et al. Mechanism of restenosis. Tex Heart Inst J, 1994,21:68-77.

2Ruoslahti E. Fibronectin and its receptors. Annu Rev Biochem, 1988,57:503-513.

3Sambrook J, Fritsch EF, Mancatis T. 分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫等译.第2版.北京：科学出版社，1995，17-56.

4苏慧慈.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994，59-115.

5Casscells W, Robert, Jeffrey A, et al. Neointima Formation after acute vascular injury: role of counteradhesion matrix protein. Tex Heart Inst J, 1994,21:78-85.

6Madri JA, Basson MD, Extracellular matrix-cell interactions: dynamic modulators of cells, tissue and organism structure and function. Lab Invest, 1992,66:519-621.

7Clowes AW, Reidy MA, Clowes MM. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. Lab Invest, 1983,49:327-333.

(收稿：1997-08-26修回：1998-01-29)