关键词： 培哚普利；醛固酮；CYP11B2基因；肠系膜动脉离体灌注

【摘要】目的评价血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂在减轻甚至逆转高血压血管损害中的潜在作用。方法用肠系膜动脉离体灌注、HPLC和RIA检测培哚普利(一种组织渗透性ACE抑制剂)对血管合成醛固酮的影响，用RT—PCR及Southern Blot证明培哚普利对血管表达醛固酮合成酶基因-CYP11B2 mRNA的作用。结果培哚普利抑制血管合成醛固酮及CYP11B2 mRNA在血管中的表达。结论培哚普利治疗高血压血管损伤的机理包括抑制血管合成醛固酮。

Perindopril inhibits aldosterone biosynthesis and CYP11B2 mRNA expression in vasculatureWu Pingsheng, Liang Xinwei, Guo Zhigang, et al. Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the potential actions of angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors on blood vessels.MethodsBy means of ex vivo mesenteric artery perfusion, HPLC and RIA, aldosterone in the perfusate was measured in normal (n=10) and perindopril (a tissue penetrative ACE inhibitor) treated (n=10) groups. The expression of aldosterone synthase gene CYP11B2 mRNA in the vessels was determined by RT-PCR and Southern blot.ResultsPerindopril inhibited aldosterone production and CYP11B2 mRNA expression in the blood vessels. ConclusionThe inhibition of aldosterone biosynthesis is involved in the remedy of hypertensive vascular damage by perindopril.

【Key words】perindoprilvascular aldosteroneCYP11B2 geneex vivo measenteric artery perfusion

作为高血压靶器官损害的确切部位，血管同脑、视网膜、心脏及肾脏一样，在持续性高血压发生发展中可能起关键作用^［1］。由于血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂在减轻甚至逆转高血压血管损害中的潜在作用需要认真评价。为此，我们研究，一种组织渗透性ACEI培哚普利能否抑制血管合成醛固酮。

材料和方法

1.肠系膜动脉离体灌注 雄性Wistar鼠（中国医学科学院动物所购买），体重220～250g，所有动物随机分为两组，每组10只动物，一组为对照组，另一组予以培哚普利2mg*kg^-1*d^-1口服14天。乙醚麻醉动物，分离腹主动脉及肠系膜动脉，按照McGregor^［2］修饰法，行离体肠系膜动脉灌注，灌注液用Krebs-Ringer溶液，pH7.4，预温37℃并与95%O₂+5%CO₂混合气体饱和，灌注泵用Baxter产品，流速4ml/min，灌注时间1小时30分钟，弃前30分钟液体。留置240ml液体，用Sep-Pak C18柱（Water产品）提取灌注液，提取液在FTS Systems冷冻干燥机（美国产品）中冻干，用甲醇溶解至30μl，10μl用于反向高效液相; 余20μl再次冻干，蒸馏水200μl溶解,100μl用于放免检测血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）。

2.反向高效液相(HPLC)分离：醛固酮反向高效液相仪（日本岛津产品），ODS柱，SPD-10AV紫外检测仪280处监测，流动相为40%甲醇，60%水，流速1.5ml/min，真正醛固酮（Sigma产品）的保留时间（RT）为30分钟，上样标本取第30分钟1.5ml，再次冻干，蒸馏水100μl溶解用于放免检测。醛固酮及Ang II放免检测试剂盒为北京北方所产品，孵化时间24小时。

3.提取总RNA：肠系膜动脉离体灌注前，留取主动脉，液氮中速冻，保存于－70℃。RNA提取液用6mol/L异硫氰酸胍（Serva产品）溶液，于紫外分光光度计260nm处测量总RNA含量。

4.RT-PCR扩增醛固酮合成酶基因（P450aldo，又名CYPⅡB2）：取1μg总RNA行RT-PCR扩增，RT试剂盒购自宝灵曼公司，为AMV逆转录酶，步骤按制造商要求进行，反应温度25℃10分钟，42℃60分钟。CYPⅡB2 PCR引物序列分别为：5'-ACCATGGATGTCCAGCAA-3'和5'-GAGAGCTGCCGAGTCTGA-3'^［3］；并以β-actin参照，其引物序列分别为：5'TTTCTGCGCAAGTTAGGTTTTGTCAA-3'和5'-CCTAGCACCATGAAGATCAA-3'^［4］。上述引物由上海细胞所合成。Taq酶为Promega产品，PCR反应温度分别为变性94℃ 1分钟，退火56℃1分钟，延伸72℃2分钟，循环30次。取6μlPCR产物于1.5%琼脂糖中电泳。

5.Southern Blot杂交：RT-PCR产物电泳后转移至Hybond N⁺尼龙膜上，分别与地戈辛随机引物标记（试剂盒为宝灵曼公司产品）的CYPⅡB2 cDNA^［5］及β-actin cDNA杂交。标记法按制造商要求。于68℃预杂交6小时，杂交18小时。按制造商要求洗膜、显色。

6.统计学处理：用t检验。

结果

HPLC上真正的醛固酮保留时间为30分钟(图1)，在该保留时间内留取标本，冻干后用RIA方法来检测，正常对照组大鼠肠系膜动脉离体灌注的灌注液中醛固酮浓度为918.6±89.5pg/1h，服用培哚普利的大鼠灌注液中醛固酮浓度为648.2±67.6pg/1h。两组之间差异有显著性。图2所示，CYP11B2的转录产物为297个碱基对，在电泳带上可清楚地看到，用培哚普利处理的主动脉中CYP11B2的mRNA的表达明显下调。

讨论

有报道证实肾上腺外组织—血管和脑^［6］能合成醛固酮。越来越多的证据表明ACEI能否抑制组织ACE，对评价它的药效和药代动力学效应非常重要。已证实培哚普利为一种组织渗透性ACEI,且是ACEI中唯一可透过血脑屏障的制剂^［7］。本实验证实了培哚普利能抑制血管醛固酮的合成，且下调主动脉CYP11B2 mRNA的表达，结果进一步解释了培哚普利治疗高血压血管损害的作用机理。

图1真正醛固酮(3μg)HPLC结果

图2培哚普利抑制CYP11B2 mRNA在血管中的表达

本课题由广东省自然科学基金资助(编号950555)

参考文献

1Brilla CG, Rupp H, Funck R, et al. The renin-angiotensin-aldosterone system and myocardial collagen matrix remodeling in congestive heart failure. Eur Heart J, 1995, 16(Suppl): 107-109.

2Miyamori I, Yasuhara M, Ikeda M, et al. Participation of vascular prostacyclin for the pathogenesis of experimental glucocorticoid hypertension in rats. Clin Exp Hypertens, 1985, A7:513-524.

3Oaks MK,Raff H. Differentiation of the expression of aldosterone synthase and 11 B-hydroxylase mRNA in the rat adrenal cortex by reverse transcriptase polymerase chain reaction. J Steroid Biochem Mol Biol, 1995, 54:193-199.

4Junji N, Xi C, Hasna J, et al. cAMP induces up-regulation of ETA receptor mRNA and increases responsiveness to endothelin-1 of rat aortic smooth muscle cells in primary culture. Biochem Biophy Res Commun ,1992, 188:719-726.

5Imai M, Shimada H, Okada Y, et al. Molecular cloning of a cDNA encoding aldosterone synthase cytochrome P-450 in rat adrenal cortex.FEBS, 1990, 263:299-302.

6Gomez Sanchez EP, Zhou M, Gomez Sanchez CE. Mineralocorticoids, salt and high blood pressure. Steroids, 1996, 6:184-188.

7Johnston CI, Fabris B, Yamada H et al. Comparative studies of tissue inhibition by angiotensin converting enzyme inhibitors.J Hypertens, 1991,9:H30-35.

(收稿：1997-07-22修回：1998-02-19)

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