关键词： 一氧化碳；高血压；内皮素缩血管肽类

【摘要】目的探讨内源性一氧化碳(CO)对内皮素-1(ET-1)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响。方法体外培养Wistar鼠主动脉VSMC，用ET-1诱导其增殖，用氯血红素诱导血红素氧合酶-1(HO-1)，促进CO生成，测定培养上清液中碳氧血红蛋白(COHb)含量和VSMCs ³H-胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)参入量。结果加入梯度浓度氯血红素10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L, 培养上清液中COHb量分别增高8.3%、14.6%和16.7%(P＜0.05或P＜0.01)，对由ET-1增高的VSMCs ³H-TdR参入量抑制率分别为22.9%，43.9%和51.7%(P＜0.01)，与加入的氯血红素及上清液中COHb含量呈浓度依赖关系。结论VSMCs产生的CO对ET-1刺激的平滑肌细胞的增殖有抑制作用。提示血红素-HO-CO系统在血管重塑中有一定作用。

the inhibition of endogenous carbon monoxide on vascular smooth muscle cell proliferation induced by endothelin-1 Cheng Youqin¹, Wu Shanshan¹, Wang Shiwen², et al. 1.Beijing Military General Hospital PLA, Beijing 100700; 2.General Hospital, PLA, Beijing 100853; 3.Beijing Medical University. Beijing 100083

【Abstract】ObjectiveTo determine the effect of endogenous carbon monoxide (CO) on vascular smooth muscle cells (VSMCs) proliferation induced by endothelin-1 (ET-1).MethodsWistar rat aortic VSMCs were cultured in vitro and stimulated to proliferate by endothelin-1 (ET-1 10^-7mol/L), hemin (a substrate and inducer of HO-1) was added in gradient concentrations of 10, 20 and 40μmol/L to induce CO production. The relative amount of CO released into the media was quantitated as carbon monoxide hemoglobin (COHb). ResultsWith hemin added in gradient concentrations, ³H-TdR incorporations of VSMCs were reduced 22.9%, 43.9% and 51.7%, respectively (P＜0.01). The reduction was dependent on the amount of added hemin and the concentration of COHb in the media. ConclusionEndogenous CO released from VSMCs has an inhibitive effect on VSMCs proliferation induced by endothelin-1 (ET-1). The HO-CO system might play an important pathophysiologic role in the vasculature remodeling when high level of ET-1 is present.

【Key words】carbon monoxidehypertensionendotheline

近年研究证实，内源性一氧化碳(CO)不仅是中枢神经的细胞信使，也是心血管系统的细胞信使^［1～4］。高血压病的发病机制目前尚不完全清楚。其重要病理变化是血管平滑肌细胞（VSMC）异常增殖，造成管壁增厚，血管重塑。已有实验和临床研究证实，高血压时内皮素-1(ET-1)水平增高^［5］，ET-1在VSMC异常增殖中起重要作用^［6］。最近有人观察到，鼠VSMC在低氧培养条件下，ET-1的促VSMC增殖作用可被内源性CO抑制^［7］。但在常氧和ET-1增高情况下(类似于临床高血压病的情况)，内源性CO对VSMC异常增殖的作用尚不清楚。本实验观察内源性CO，对在常氧培养情况下由ET-1刺激的鼠主动脉VSMC异常增殖的影响，以便探讨血红素-HO-CO-cGMP系统在高血压病血管VSMC增殖中的作用。

材料与方法

胎牛血清(FBS)购自GibcoBRL公司；RPMI1640培养液(1640)、氯血红素(Hm)、ET-1、牛血红蛋白均购自Sigma化学公司；³H-TdR为北京原子能研究所产品(放射比活度为28Ci/mmol)。其他试剂均系进口或国产分析纯。

细胞培养：Wistar鼠(购自中国医学科学院实验动物所)，6周龄，雄性，断颈处死，无菌条件速取主动脉，贴块法进行VSMC培养。实验采用6～8代细胞。

培养上清液碳氧血红蛋白(COHb)测定：制备1×10⁵细胞/ml悬液，接种于12孔板，含20%FBS的1640孵育48小时，换1%FBS的1640孵育24小时，换10%FBS的1640，并按以下实验分组(每组6孔)分别加入试剂：A组：空白对照组；B组：加入ET-1 10^-7mol/L；C、D、E组分别加入Hm终浓度10μmol/L，20μmol/L，40μmol/L；F组：加入ET-1 10^-7mol/L及Hm 40μmol/L；孵育24小时，参照Morita等^［7］的方法，实验结束前1小时加入牛血红蛋白50μmol/L。实验结束取培养上清液在GD3022型酶标测定仪570nm检测COHb消光数。

³H-胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)参入测定：制备5×10⁴细胞/ml悬液，接种于24孔板，含20%FBS的1640孵育48小时，换1%FBS的1640孵育24小时，换10%FBS的1640，按实验分组(每组6孔)分别加入以下试剂：空白对照组（C组）；E组：加入ET-1 10^-7mol/L；EH 1组、EH 2组、EH 3组，均加入ET-1 10^-7mol/L及分别再加入Hm10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L；H组：加入Hm 40 μmol/L。孵育6小时后，每孔加入1μci³H-TdR，孵育12小时，加入冷PBS液终止反应，在Millipore上经0.45μm微孔滤膜抽滤收集细胞，用10%三氯乙酸处理，滤膜烘干，置闪烁瓶内，加闪烁液，静置过夜，在FJ-2105型液体闪烁计数仪上测定3H放射活性，并计算DPM。

统计学处理：应用SDAS统计软件作方差分析(SNK检验)。

结果

1.Hm浓度与COHb的关系(图1)：与对照组相比，加入梯度浓度Hm，COHb增加(P＜0.05或P＜0.01)，呈浓度依赖趋势，但P＞0.05。

2.ET-1与CO产生量的关系(图1)：与对照组相比，仅加入ET-1 COHb无明显变化；E组与F组比较，未发现ET-1对COHb生成的影响。

3.ET-1对VSMC增殖的影响(图2)：与对照组相比，加入ET-1，³ H-TdR参入量增加了5.3倍，证实了ET-1促VSMC增殖作用。

4.内源性CO对ET-1促VSMC增殖的抑制作用(图2)：在加入ET-1的同时，加入梯度浓度的Hm，³H-TdR参入明显减少(P＜0.01)，并呈剂量依

图1ET-1不同浓度氯血红素对培养上清液中COHb的影响(n=6；与A组比较，^*P＜0.05,^**P＜0.01)

图2不同浓度氯血红素对ET-1诱导的VSMC增殖的影响(n=6;与C组比较，⁺P＜0.01；与E组比较，^*P＜0.01；与EH1组比较，^△P＜0.01；与EH2组比较，^▲P＜0.05)

赖关系(P＜0.01或P＜0.05)，抑制率分别为22.9%、43.9%和51.7%。

5. 内源性CO对基础状态VSMC增殖的影响(图2)：不加ET-1，单用最大浓度Hm，³H-TdR参入量无明显变化(P＞0.05)。

讨论

高血压病发病机制目前尚不完全清楚，但已被公认为一种多基因多因素疾病。近年动物实验证实，血红素-HO-CO系统在血压调控中起到重要作用。有实验证实，HO的作用底物血红素可急性降低高血压鼠增高的血压，但不降低正常血压鼠的血压^［8］。我们推测，高血压时HO-CO系统可能存在异常。VSMC异常增殖是高血压重要病理生理改变，而高血压时ET-1水平增高在VSMC异常增殖中起重要作用。

内源性CO直接检测十分困难。在生物体内血红蛋白(Hb)是CO的天然捕捉剂和清除剂，内源性CO在组织内产生，发挥生物学效应后与Hb结合，形成COHb，随血液循环到肺，与Hb解离，随呼出气排出体外。体外研究证实，培养上清液中COHb的数量可以反映培养细胞CO的产生量。本实验与文献报道结果一致，在加入梯度浓度Hm后，培养上清液中COHb分别增加8.3%、14.6%和16.7%。证实血红素既是HO的作用底物，又是HO-1的有效诱导剂。

胸腺嘧啶核苷是细胞增殖中DNA合成的必要原料。本实验在常氧培养条件下由ET-1刺激Wistar鼠主动脉VSMC的³H-TdR参入量比基础状态增加5倍，进一步证实了ET-1对VSMC增殖的促进作用。同时应用梯度剂量的Hm，细胞增殖被部分抑制。

已知在HO作用下，血红素被分解成CO和胆绿素，胆绿素在胆绿素还原酶的作用下迅速转化为胆红素，胆绿素和胆红素都是很强的抗氧化剂，已发现具有重要生物学作用，但未发现有抑制细胞增殖的作用。本实验中Hm对细胞增殖的抑制作用，与CO的产生量呈浓度依赖关系。但在未加用ET-1的情况下，Hm并未显示出对细胞增殖的抑制作用，提示在基础状态下，HO-CO系统对VSMC增殖并无明显作用。同时除外Hm对VSMC的细胞毒作用。

本实验证实在ET-1增高的情况下，如临床高血压病，若血红素-HO-CO系统激活，可能部分抑制由ET-1刺激的VSMC过度增殖。由此推测，血红素-HO-CO系统在高血压病的发病及病理生理过程中可能发挥重要生物学作用。

目前尚不清楚，高血压时血红素-HO-CO系统的状态如何。推测有三种可能：一是被某些因子激活，高于正常人；二是被某些因子抑制，使其不能发挥正常作用(这种抑制可在基因水平，蛋白水平，活性水平等)；三是与正常人水平相当，