关键词： 醛固酮；基因；原位杂交

【摘要】目的为证明不仅血管、大脑，而且其它肾上腺外组织合成醛固酮假设的可能性。方法进行了两项实验研究：(一)确定肾脏能否合成醛固酮。用离体肾灌注模型，观察血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)及肾上腺切除对离体肾灌注醛固酮产量的作用，在30分钟平衡之后，收集120ml灌注液行反向高效液相分离及放免检测。研究表明肾脏离体灌注可以释放醛固酮、肾上腺切除不会改变肾灌注液中的醛固酮产量、而用ACEI培哚普利则可减少其产量；用RT-PCR及Southern Blot法证明了肾组织及培养的肾小管上皮细胞能表达醛固酮合成酶基因-CYP11B2 mRNA。(二)确定肝脏和肺脏能否合成醛固酮。结果用RT-PCR及Southern Blot法证明了肝脏和肺脏能表达CYP11B2，原位杂交表明CYP11B2 mRNA定位在肝脏的伊藤细胞及肺脏的Ⅱ型肺泡上皮细胞的胞浆内。结论研究证明了肾脏、肝脏及肺脏能够合成醛固酮。

Aldosterone biosynthesis in extraadrenal tissues Wu Pingsheng, Liang Xinwei, Dai Yun, et al. Nanfang &127;Hospital, First Military Medical University, PLA, Guangzhou 510515

【Abstract】ObjectiveTo determine the hypothetical possibility that extra-adrenal tissues could also synthesize aldosterone besides the vascular tissue and brain.Methods Aldosterone released into the perfusion circuit from the exvivo perfused rat kidney model, and the effects of ACEI and adrenalectomized rats prior to the perfusion experiment on aldosterone production from the kidney model were studied. After 30 min equilibration 120 ml of the perfusate was collected and subjected to reverse-phase HPLC. Production of aldosterone in the kidney perfusate was determined by RIA. The expression of aldosterone synthase gene-CYP11B2 mRNA was measured by RT-PCR, Southern blot and in situ hybridization.Results Production of aldosterone in the kidney perfusate showed no change in adrenalectomized rats, but it was decreased in the kidney perfusate from rats pretreated with ACEI (perindopril). The expression of CYP11 B2 mRNA was demonstraled in both kidney tissue and cultured renal tubular epithelial cell. CYP 11B2 mRNA expression was identified in the liver and lung of rats. In situ hybridization showed that CYP11B2 mRNA was localized in the endoplasm of liver fat -storing cell (Ito cells) and typeⅡ alveolar cells of the lung .Conclusion These studies indicate that kidney, liver and lung are able to produce aldosterone.

【Key words】aldosteronegenein situ hybridization

Takeda等^［1］报道有组织存在肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system)，但是，始终没有组织存在肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)及肾上腺外组织合成醛固酮(aldosterone)的证明。直到1992年，Brilla等^［2］报道血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,Ang Ⅱ)诱导培养的主动脉细胞产生醛固酮。此后，我们进行了血管合成醛固酮的系列论证工作^［3］。现我们首次报告肾上腺外组织——肾脏、肺脏及肝脏合成醛固酮。

材料与方法

1.肾脏离体灌注：雄性Wistar鼠(中国医学科学院动物所购买)，体重220～250g，随机分为三组，每组10只鼠，一组为对照组，一组灌注前30小时切除双侧肾上腺，一组予以培哚普利(一种组织渗透性ACEI，法国施维雅药厂产品)2mg·kg^-1.d^-1口服14天。乙醚麻醉动物，分离左肾动脉，按照McGregor等^［4］修饰法，行离体肾灌注，灌注液用Krebs-Ringer溶液，pH 7.4，预温37℃并与95%O₂+5%CO₂混合气体饱和，灌注泵用Baxter产品，流速4ml/min，监测灌注压，灌注时间1小时，弃前30分钟液体。留置120ml液体，用Sep-Pak C18柱(Water产品)提取灌注液，提取液在FTS Systems冷冻干燥机(美国产品)中冻干，用甲醇溶解至30μl，10μl用于反向高效液相。

2.反向高效液相(HPLC)分离及放免检测醛固酮：反向高效液相仪(日本岛津产品)，ODS柱，SPD-10AV紫外检测仪280mm处监测，流动相为40%甲醇，60%水，流速1.5ml/min，真正醛固酮(Sigma产品)保留时间(RT)为30分钟，上样标本取第30分钟1.5ml，再次冻干，蒸馏水100μl溶解用于放免检测。醛固酮放免检测试剂盒为北京北方所产品，孵化时间24小时。

3.肾小管上皮细胞培养：肾小管上皮细胞株(美国ATCC公司产品)，培养条件：10%FCS加入F12-DMEM培养液中，37℃、5%CO₂于CO₂孵箱中培养2周，每2天换一次培养液，收获细胞。

4.提取总RNA：肾离体灌注前，留取右肾、肺、肝脏及肾上腺，液氮中速冻，保存于-70℃。RNA提取液用6mol/L异硫氰酸胍(SERVA产品)溶液，于紫外分光光度计260nm处测量总RNA含量。

5.RT-PCR扩增醛固酮合成酶基因(P450aldo,又名CYP11B2)：取1μg总RNA行RT-PCR扩增(RT试剂盒购自宝灵曼公司，为AMV逆转录酶，步骤按说明书要求进行)，反应温度25℃10分钟，42℃ 60分钟。CYP11B2 PCR引物序列分别为：5＇-ACCATGGATGTCCAGCAA-3＇和5＇-GAGAGCTGCCGAGTCTGA-3＇^［5］；位于该基因第657-954位硷基(由上海细胞所合成)。Taq酶为Promega产品，PCR反应温度分别为变性94℃1分钟，退火56℃ 1分钟，延伸72℃2分钟，循环30次。取6μl PCR产物于1.5%琼脂糖中电泳。

6.Southern Blot杂交：RT-PCR产物电泳后转移至Hybond N⁺尼龙膜上，分别与地高辛随机引物标记(试剂盒为宝灵曼公司产品)的CYP11B2 cDNA^［6］杂交。于55℃预杂交6小时，杂交18小时。按说明书要求洗膜、显色。

7.原位杂交：按照Yabu^［7］修饰法，SD鼠200～250g，乙醚麻醉，用生理盐水及4%多聚甲醛灌注后，留取肝脏和肺脏，在多聚甲醛固定液中于4℃浸泡4小时，冰冻切片，厚度20μm。 原位杂交时室温预杂交8小时，在杂交液中加入地戈辛随机引物标记(如上述)的CYP11B2 cDNA 0.25μg/ml，42℃杂交24小时。杂交毕后，洗30分钟。按制造商要求显色。

8.组织学：肺组织石蜡切片用McNary法染色。肝组织冰冻切片在0.02%氯化金溶液中室温浸泡6小时，然后在5%硫代硫酸钠中放置5min后封片。光镜下观察切片。

9.统计学处理用t检验。

结果

HPLC上真正的醛固酮保留时间为30分钟，在该保留时间内留取标本，冻干后用RIA方法检测，正常对照组肾离体灌注液中醛固酮浓度为285.84±14.28pg/30min，肾上腺切除组尽管血浆醛固酮不能测定到，肾灌注液中仍有259.62±17.24pg/min的醛固酮，与正常对照组比较差异无显著性。而服用培哚普利鼠灌注液中醛固酮浓度为232.67±16.18pg/30min。与正常对照组比较差异有显著性(P＜0.05)。

图1示297bp CYP11B2的转录产物在肾上腺、肾、肾小管上皮细胞、肺及肝脏的电泳带上可清楚地看到。随培养的肾小管上皮细胞中模板RNA量增加，RT-PCR的产量也随之增加。原位杂交表明在肝的储脂细胞(伊藤细胞，图2)及肺的Ⅱ型肺泡细胞(图3)的胞浆内可见CYP11B2探针着色。这些细胞分别由氯化金染色(图4)及McNary法染色(图5)进一步确定。

图1CYP11B₂ mRNA在肾上腺及肾上腺外组织表达

图2原位杂交表明CYP11B2 mRNA在肝脏储脂细胞中表达(×40)图3原位杂交表明CYP11B2 mRNA在Ⅱ型肺泡细胞中表达(×40)图4氯化金着色的肝脏储脂细胞(×20)图5McNary法着色的Ⅱ型肺泡细胞(×20)

讨论

醛固酮不会在肾上腺内储存，放射标记醛固酮研究表明其半衰期约30分钟。本实验弃去了前30分钟灌注液，仅保留后30分钟用于高效液相，以排除醛固酮与肾脏盐皮质激素受体结合导致本结果的可能性。用高效液相纯化排除了醛固酮前体物质与其放免试剂盒交叉反应的可能性。双肾上腺切除30小时后，虽然血浆醛固酮不能检测到，但肾灌注液中仍存在醛固酮；当用培哚普利预处理动物时，其肾脏产生的醛固酮明显减低。这结果均表明肾脏能够合成醛固酮。

我们用RT-PCR及Southern Blot技术证明了CYP11B2 mRNA在肾脏、肝脏及肺脏表达。原位杂交表明它位于肝脏的伊藤细胞和肺的Ⅱ型肺泡上皮细胞。由此证明了不仅血管^［3］、大脑^［8］，而且肾脏、肝脏和肺脏均能合成醛固酮