关键词： 成纤维细胞生长因子，碱性；胶原；血管

Role of basic fibroblast growth factor on procollagen α₁［Ⅰ］ and α₁［Ⅲ］ mRNA expression in vascular smooth muscle cells and arteries denuded with balloon catheter

Zhou Yujie, Wang Lihui, Ke Yuannan, et al

【摘要】 目的 使用α1［Ⅰ］，α1［Ⅲ］人胶原cDNA探针进行Northern杂交技术，观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对血管平滑肌细胞及内膜损伤后血管前胶原α1［Ⅰ］，α1［Ⅲ］ mRNA表达的影响。方法 将bFGF加入培养的平滑肌细胞，可以促使前胶原α1［Ⅰ］，α1［Ⅲ］mRNA的表达。雄性Sprague-Dawley大鼠分为四组：颈动脉内膜球囊损伤+bFGF、颈动脉内膜球囊损伤+bFGF抗体、颈动脉球囊损伤、正常对照血管，上述各组实验后1周检测分析前胶原mRNA的表达及3周检测各组血管的胶原含量。结果 bFGF对内膜损伤后血管前胶原α1［Ⅰ］，α1［Ⅲ］mRNA表达有明显的促进作用(P〈0.01)，bFGF对血管胶原含量也有促进作用，应用bFGF特异性抗体可以阻滞上述作用。结论 bFGF不仅刺激成纤维细胞等细胞的分裂增殖，对血管平滑肌细胞及损伤后血管前胶原α1［Ⅰ］，α1［Ⅲ］mRNA的表达有明显促进作用，揭示它可能是损伤后血管胶原代谢中的重要因素，对损伤后血管重塑有一定的作用。

Role of basic fibroblast growth factor on procollagenα1［Ⅰ］ and α1［Ⅲ］ mRNA

expression in vascular smooth muscle cells and arteries denuded with balloon catheter

zhou Yujie, Wang Lihui, Ke Yuannan, et al. Department of Cardiology, China-Japan friendship

hospital, Beijing 100029

【Abstract】 Objective Effect of basic fibroblast growth factor(bFGF) on type Ⅰ（α₁［Ⅰ］)，type Ⅲ (α₁［Ⅲ］) collagen mRNA expression was assessed in cultured vascular smooth muscle cells and the vessel wall after balloon injury.Methods In vivo experiment, the endothelium of carotid arteries of rats were denuded with balloon catheter (2F Fogarty balloon catheter) and were administered bFGF or bFGF antibody. Human collagen α₁［Ⅰ］，(α₁［Ⅲ］) cDNA probes and Northern blotting hybridization were employed to quantitate procollagen mRNA changes in cultured vascular smooth muscle cells (SMCs) and arteries denuded with balloon catheter.Results The data indicate that bFGF increased the procollagen α₁［Ⅰ］，α₁［Ⅲ］mRNA levels in cultured SMCs.Administration of bFGF (40μg/d) caused a significant increase of α₁［Ⅰ］，α₁［Ⅲ］ procollagen mRNA expression of vessel wall after balloon injury. The vascular collagen content was also increased.The effect of bFGF was significantly decreased by bFGF antibody.Conclusion The results of this study support that bFGF is an important factor in controlling collagen metabolism of vascular smooth muscle cells and the vessel wall after balloon injury. It may play a significant role in vessel remodeling after balloon injury.

【Key words】 fibroblast growth factor, basic collagen blood vessels

血管介入损伤后再狭窄(RS)成为影响血管成形术疗效的最大障碍。血管再狭窄机制与血管损伤后弹性回缩、血栓形成、新生内膜形成以及胶原等基质参与的血管重塑有关^［1，2］。上述病理变化是多种生长因子共同参与作用的结果。已往对成纤维细胞生长因子(FGF)的认识局限于与成纤维细胞关联的作用。现已证实，FGF是强烈的促细胞分裂因子，在血管损伤后平滑肌细胞增殖及向内膜迁移起着重要作用^［3，4］。本研究主要观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对平滑肌细胞及损伤后血管Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA的影响。

材料与方法

1.细胞培养、细胞总RNA的制备与鉴定：断头处死大鼠，立即在无菌操作下取出主动脉，分离血管中膜并剪成0.1～0.3mm²小块放于25ml卡氏培养瓶中，置37℃的CO₂孵育箱内培养。约7～10天可见细胞从组织块周围萌出，待原代细胞生长融合达3/4培养面即传代，将6～10代细胞传代于卡氏培养瓶(4×10^４个/ml)，待细胞融合时，将培养基换成20%胎牛血清(FCS)的M199培养液，24小时后再换成含0.5%FCS的M199培养液，同时加入bFGF5μg/ml，相同样品4瓶，对照组不加FGF，3天后收集细胞，采用一步法提取细胞总RNA^［5］。用甲醛凝胶电泳鉴定，可见清晰的20S及18S两条带。OD260/OD280约为2。

2.动物分组实验及血管局部组织取材：Sprague-Dewley雄性大鼠(北京医科大学动物室)，3～4个月龄，270～340g，麻醉后暴露颈动脉，送入Fogarty球囊导管反复拉3次，造成颈动脉内膜损伤，结扎动脉远端，实验大鼠划分为四组：第一组为颈动脉内膜拉伤后每日静脉注射40μg的bFGF(购自Sigma公司)；第二组为动脉内膜损伤后每日静注10mg bFGF的抗体(购自Sigma公司，第一次为动脉内膜拉伤前5分钟)；第三组为单纯动脉内膜拉伤大鼠；第四组为正常对照大鼠。前两组分别于用药1周，各组分别由第1周，第3周后处死迅速取出实验血管段，投入液氮中制成组织匀浆。

3.羟脯氨酸(HYP)测定：取200ml组织匀浆测定HYP，间接反映组织胶原含量(HYP由

13.4%胶原构成)加入100%乙醛400μl置冰浴1小时，离心20分钟(12000g)，蒸发上清，加入100μl的MilliQ-H₂O，每个样品加入178000dpm［³H］-羟脯氨酸，加入2ml的6N hCl水解24小时，水解物添加炭浆240mg/ml，离心10分钟(2000g)，弃上清后再加10ml的MilliQ-H₂O，取出100μl混悬液测定［³H］-羟脯氨酸缺失量及校正量。分别取二份50μl悬液比色法测定HYP浓度^［6］(mg/g表示)。

4.组织蛋白质RNA检测及RNA分析：取200μl组织匀浆，加入0.2N高氯酸(PCA)2ml置于冰浴1小时，12000g离心10分钟，弃上清，沉淀物加入0.2N PCA 2ml洗涤，将沉淀物溶解于0.3N KOH 1ml，60℃加热1小时，将50μl KOH溶解液加入0.15N NaCl 950μl，由

lowry方法测定总蛋白量^［7］。将冷冻的血管段应用Chomczynsk-Sacci^［8］法提取总RNA，OD260/OD280确认为1.8，总RNA变性后进行甲醛变性胶电泳，转膜每个孔同等量的RNA(5μg)，进行预杂交及与探针杂交，预杂交液(6×SSC，1×Denhard液，0.5%SDS，0.005%焦磷酸盐)。

5.探针的制备、鉴定、标记及检测：人胶原α1［Ⅰ］^［9］，α1［Ⅲ］^［10］链cDNA重组质粒。碱裂解法提取纯化重组质粒。α1［Ⅰ］cDNA重组质粒进行EcoRⅠ及Ndel Ⅰ双酶切，α1［Ⅲ］用EcoR Ⅰ酶切。酶切后，用0.7%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收相应的DNA。其长度分别为4.6kb、及4.5kb。以相应的限制性内切酶酶切鉴定，所得结果与报道酶切图谱一致。磷酸-3-甘油醛脱氢酶(GAP)cDNA用作内标准，cDNA插入片段为1.261kb^［11］。探针的标记采用同位素随机引物。用α-³²P-dNTP缺口翻译标记探针，比活性为5-10×10⁷Cpm/μg。

结 果

1.bFGF对平滑肌细胞前胶原基因α1［Ⅰ］，α1［Ⅲ］mRNA影响：培养6～8代的SMC_S加入bFGF 5μg/ml，3天后搜集细胞提取RNA进行Northern分析，与对照组培养平滑肌细胞相比α1［Ⅰ］，α1［Ⅲ］mRNA表达均明显增强。

2.实验血管组织胶原蛋白含量：图1示血管损伤后第3周，4组动物血管壁胶原含量分析，应用bFGF组胶原含量为52±0.14mg/g，血管拉伤组为38±1.32mg/g，抗bFGF组为25±0.12mg/g，正常组为20±1.10mg/g，bFGF组血管壁胶原含量较血管拉伤对照组增高(P〈0.01)；应用抗bFGF使胶原含量下降，较血管损伤对照有显著差异(P〈0.01)。图2示血管胶原与蛋白对比分析，bFGF组胶原含量约占蛋白成分的50%，但应用bFGF抗体后，其血管胶原较血管拉伤对照组有显著差异(P〈0.01)。

图1 bFGF对实验血管组织胶原蛋白含量的影响

图2 实验血管胶原与蛋白含量对比分析(A=颈动脉内膜损伤后+静脉注射40μg的bFGF/日；B=单纯动脉内膜损伤；C=动脉内膜损伤后+静注10mg bFGF的抗体；D=正常对照血管；图3同此)

图3 Northern blot分析实验血管段α1［I］，α1［Ⅲ］胶原与GAPDH mRNA的表达

3.实验血管段前胶原基因的表达：图3表示四组动物在实验后一周检测损伤后血管Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA的表达水平。α1［Ⅰ］，α1［Ⅲ］胶原与GAPDH m<