关键词： 心肌病，充血性；心肌炎；受体，胆碱能；自身抗体

A study of anti-muscarinic receptor antibodies in sera fro

m patients with viralmyocarditis and dilated cardiomyopathy

【摘要】 目的 M受体和肾上腺素能受体通过自主神经调节心脏功能。在某些病理条件下，血清抗M受体抗体的产生与疾病的发生、发展密切相关。本研究拟通过对病毒性心肌炎(VMC)与扩张型心肌病(DCM)患者血清抗M受体抗体的检测，探讨该指标的辅助判断价值。方法 随机选择VMC患者32例、DCM患者12例、冠心病患者20例及正常对照组14例，受试者血清与人心室肌组织片预孵育后，冷冻切片法测定M受体与配基［³H］QNB结合的B_max与Kd值。VMC患者血清同时进行心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)测定与淋巴细胞肠道病毒逆转录扩增。结果 7例正常人(意外死亡者)心室肌M受体与配基［³H］QNB结合的B_max值为51.4±6.0 fmol/L·mg pr, Kd值为

0.68±0.09 nmol/L。DCM患者血清孵育后M受体和配基结合的B_max值下降(P〈0.01),

kd值升高(P〈0.01)；VMC患者仅Kd值升高(P〈0.01)，但cTnI阳性及病毒扩增阳性者B_max值同时下降(P〈0.05)。结论 VMC和DCM患者血清中存在抗M受体抗体，其导致心肌M受体和配基结合的数目与亲和力改变，对DCM诊断以及VMC向DCM演变可能提供有益的证据。

A study of anti-muscarinic receptor antibodies in sera from patients with viral myocarditis

and dilated cardiomyopathy Su Enben, Yang Di, Wang Hui, et al. the First Affiliated Hospital,

nanjing Medical University, Nanjing 210029

【Abstract】 Objective Muscarinic receptor (MR) and adrenergic receptors in human heart play

an important role in maintaining physiologic function. In some clinical cases, the level of serum anti-MR antibodies was reported to be related to the pathogenesis and progress of diseases. This work was designed to investigate the concentration of anti-MR autoantibodies in sera from patients of viralmyocarditis (VMC) and dilated cardiomyopathy (DCM) and evaluate the significance as a diagnostic marker.Methods Thirty two patients with VMC, 12 DCM, 20 coronary heart disease (CHD)(total 64 cases) and 14 normals were enrolled and blood samples were collected. The level of autoantibodies in sera was determined by inhibition of ³H-QNB binding on incubation left ventricular slide with the patients′ sera. Serum cardiac troponin I (cTnI), a specific marker reflecting cardium injury was assayed as well enterovirus RNA was detected by RT-PCR.Results The value B_max and kd of MR on ventricule of seven normal subjects were 51.4±6.0 fmol/mg·pro and 0.68±0.09 nmol/L,respectively. After preincubation with sera from patients of DCM, the B_max of mR decreased, while kd value increased (P〈0.01). Sera of VMC patients only caused increase of Kd, however, sera from VCM patients with positive cTnI and enterovirus RNA behaved similarly as those of DCM patients.

Conclusion The present data demonstrate that anti-MR autoantibodies which inhibited B_max and

affinity of cardiac MR appeared in sera from patients of DCM and VMC. The presence of anti-MR

autoantibodies might give an evidence for evaluation the progress of VMC leading to DCM and the

diagnosis of DCM.

【Key words】 cardiomyopathy, congestive myocarditis receptors, cholinergic autoantibodies

M型乙酰胆碱能受体(muscarinic acetylcholine receptor,简称M受体)和肾上腺素能受体通过自主神经调节心脏功能，M受体激活能增加迷走神经张力对抗交感神经兴奋、降低心肌耗氧量和减少心律失常的发生^［1］。在某些病理条件下，血清抗M受体抗体的产生与疾病的发生、发展密切相关^［2］。有报道兔注射M受体抗原后能导致心肌在功能和形态上产生类似扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy, DCM)改变，并证实血清抗M受体抗体参与发病过程并起重要作用^［3］。病毒性心肌炎(Virus Myocarditis, VMC)发病机理至今还未阐明，但病毒或受损心肌引起的免疫病理损伤已被众多学者认可^［4］。本研究拟通过检测VMC和DCM患者血清抗M受体抗体滴度，探讨该指标可否有助于诊断和作为VMC向DCM演变的辅助观察指标。

资料和方法

一、资料

1.病例选择：(1)随机收集本院住院与门诊VMC患者32例，平均年龄31±7.7岁，男15例，女17例，病程1～12周，未服用过胆碱能药物，其中心肌肌钙蛋白I(cTnI)阳性25例，外周血淋巴细胞肠道病毒逆转录扩增阳性15例(同时cTnI阳性)，其中发生三度房室阻滞安装临时起搏器8例。住院DCM患者12例，平均年龄58±6.5岁，男8例，女4例，心功能(NYHA分级)Ⅲ级4例，Ⅳ级8例。VMC和DCM的诊断采用1995年全国心肌炎、心肌病专题研讨会“成人急性病毒性心肌炎诊断参考标准”和“特发性扩张型心肌病诊断参考标准”。(2)正常对照(NC)组14例，平均年龄50±5.8岁，男12例，女2例，病例来源于本院献血员，经临床和实验室检查为健康者。(3)选择本院住院冠心病(CHD)患者20例，平均年龄62±6.1岁，男18例，女2例，心功能(NYHA分级)Ⅲ级10例，Ⅳ级10例。CHD诊断符合1979年国际心脏病学会和协会以及WHO临床命名标准化联合制定冠心病命名及诊断标准。

2.血样本采集：清晨采集受试者静脉血液3 ml，低温分离血清，-70℃保存待测。

3.实验仪器：恒冷切片机Ryocut 1800，液闪计数器Beckman LS1800。

4.试剂：［³H］-quinuclidinyl benzylate(［³H］-QNB)英国Amersham公司产品，比放射性35Ci/mmol。阿托品为美国Sigma公司产品。OCT为美国Miles公司产品。其它试剂为国产分析纯。

二、方法

1.人心室肌M受体测定：取意外事故死亡4小时内7例人心肌标本，分离心室肌组织，液氮速冷，-70℃保存备用。将心室肌组织修切为5×5 mm平面，OCT包埋后，在-16℃恒冷切片机柜内连续切片，厚度16 μm，取4片组织片融裱预冷的载玻片上，强冷风吹干，同时随机取组织片做蛋白定量。在组织片上分别滴加0.125～8 nmol/L ［³H］-QNB，非特异性结合组加10^-4 mol/L阿托品，以Tris缓冲液(Tris 50 mmol/L， MgCl₂10 mmol/L, pH 7.4)补足至400 μl。将玻片放入30℃孵育箱，孵育45分钟后，倾去孵育液，将玻片浸入0℃Tris缓冲液，洗脱22分钟。烘干后用刀片刮下组织片，加入5 ml闪烁液(PPO 4 g, POPOP100 mg, 溶于1 000 ml二甲苯内)平衡过夜。液闪计数器计数、Scatchart作图计算放射配基与受体结合的B_max与Kd值。

2.血清浓度抑制实验：将DCM患者血清不同倍数稀释后，与心肌组织37℃预孵育1小时，再与2 nmol/L ［³H］-QNB孵育，计算血清预孵育组配基与受体结合和血清未孵育组配基与受体结合的比值。

3.血清抗M受体抗体测定：先将载有组织的玻片分别滴加各组受试者血清400μl (1∶15稀释)，37℃孵育1小时后，再测定配基与受体结合的B_max与Kd值。

4.ELISA法测定VMC患者血清cTnI(本室建立^［5］)，PCR扩增肠道病毒^［6］。

三、统计分析

多个实验组与一个对照组之间的两两比较采用Duncan法检验。测定结果以±s表示。

结 果

1.7例人心室肌M型受体与配基［³H］-QNB结合经Scatchart分析，获人心室肌M型受体的B_max值为51.4±6.0 fmol/L·mg pr, Kd值为0.68±0.09 nmol/L，配基浓度达到2 nmol/L时结合达到饱和，非特异竞争结合率为15%～25%。

2.不同稀释倍数(1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160)的DCM患者血清与人心室肌组织预孵育后，可抑制放射性配基与心肌M受体的结合，且其抑制作用呈浓度依赖性，稀释倍数越小，抑制作用越大，1∶20时抑制作用达平台期，最大达未孵育组结合的50%。我们选择1∶15作为常规血清稀释倍数。

3.CHD、DCM、VMC患者及正常对照者血清预孵育后M受体与配基结合变化见附表。与正常对照组相比，CHD患者血清抑制后，心肌M受体与配基结合的B_max与Kd值无变化；DCM组的B_max值下降，Kd值升高，即受体数目减少与亲和力降低