摘要生物素标记法是近年来发展起来的一种分离衰老红细胞的技术。其基本原理是用生物素(NHS-Biotin)标记一定量的红细胞，使之参与血液循环，并在体衰老，利用biotin与抗生物素蛋白(avidin)之间的高亲和力，分离带有标记的、具有特定年龄的红细胞。实验证明这种技术能够精确获得不同特定年龄的红细胞亚群。该技术在临床中可取代⁵¹Cr标记法进行红细胞年龄的测定，并用来进行红细胞在体衰老过程中生物物理、生物化学特性的改变。

中图分类号

A METHOD OF SEPARATING SENESCENT ERYTHROCYTES:

THE PRINCIPLE OF BIOTINYLATION AND ITS APPLICATIONS

Reviewsed by Yao Weijuan

(Department of Medical Physics,Beijing Medical University,10083)

AbstractBiotinylation is a new technique which has been developed in recent years to separate senescent erythrocytes.Its principle is as follows:red blood cells(RBCs) are labeled with NHS-Biotin,participated in the circulation and ages in vivo.Using the high affinity between biotin and avidin,the labeled RBCs with specific ages are separated.Experiments show that this technique can enable people to precisely get the subpopulations of RBCs with different specific ages.In clinical,it can take place of ⁵¹Cr-labeling to measure the RBC′s life span.Furthermore,it can be used to study the biophysical and biochemical changes in the process of RBC′s senescence in vivo.

Keywords biotinerythrocytessenescencelife spanbiochemical characteristics

研究红细胞生存期(life span)内的在体衰老过程，对于进一步认识红细胞在正常生理状态下的发生、发展、老化、死亡的过程及病理状态红细胞的变异，阐明红细胞生命过程的机理，相关疾病的诊断治疗，提高输血效率，延长血库中血液保存期等有十分重要的基础和临床意义，各国学者对此做了大量的研究工作，并提出了许多假设。然而，由于缺乏一种分离特定年龄红细胞的方法，这方面的研究受到了阻碍。通常，人们使用物理技术来分离特定的红细胞亚群，这些技术的主要依据是：衰老红细胞的密度、体积、表面电荷和渗透脆性等物理特性与年轻红细胞相比发生了较大的变化。但是，由于使用这些技术进行的研究并不能得到一致的结论，它们都受到了不同程度的质疑^［1］。在1987年，Suzuki和Dale^［2］首次提出了用生物素标记红细胞进行合格内生存、体外恢复的方法，证明了这种方法能精确地获取不同年龄红细胞亚群，使研究红细胞在衰老过程中生物化学、生物物理特性的变化成为可能。之后，许多学者对此法进行了改进和研究，并运用这一方法研究了红细胞的衰老问题，本文将对其进行综述。

1生物素标记法的基本原理

如图1所示，使用体内注射苯肼^［3］、苯肼盐酸盐^［4］或多次失血的方法造成兔子贫血，出现网织红细胞增多症，使得动物休内的年轻红细胞比例增多。取一定量的血，用NHS-Biotin(脂溶性，N-Hydroxysuccinimidobiotin)对其进行体外标记，再将标记了的红细胞重新注入体内，这样，带有biotin标记的红细胞参与了血液循环，并随着时间的推移逐渐衰老。一定的时间间隔后，取血(既有标记的红细胞又有未标记的红细胞)，利用生物素与卵白素avidin之间的高亲合力，使带有生物素标记的红细胞与覆盖有avidin的凝胶特异结合，从而鼗带有标记的、具有特定年龄的红细胞从全血中分离出来。

图1兔红细胞的标记与恢复

许多学者对这个方法进行了改进。首先，从实验动物上，使用狗^［5-8］来取代常用的兔子。其主要原因是，狗的红细胞寿命约为115天，红细胞的随机清除率低，这与人红细胞的生存特性非常相似(人的红细胞寿命大约为120天)，而兔红细胞不仅寿命短(约为50-70天)，且具有年龄依赖的高随机消除率。不仅如此，由于狗的血量比兔子大，所以使用狗更能满足实验的需要。其次，将体外标记变为体内标记^{［5,6,9,10］}。即直接将一定的NHS-Biotin注入动物血液中，这样至少能比体外标记法多标记3-4倍的红细胞(体内标记～100%，体外标记～25-30%)^［6］，这对许多衰老研究来说是非常重要的。因为对衰老红细胞进行生化分析常需要较多的细胞数，而在标记后的一个生命周期的后期，循环血液中存在的衰老标记红细胞已相对很少，使研究不能进行。第三，从分离方法上，有的学者采用聚苯乙烯珠(polystyrenebeads)作为分离载体^［2-4］，它们与标记红细胞特异结合后，通过离心的方法将其与未标记的红细胞分离；有的学者有杉磁珠(magnetic microbeads)^［5,6,11］，与标记红细胞特异结合后，在磁场中与未标记红细胞分离；还有的采用聚苯乙烯珠微生物培养皿(polystyrene microbiologic petric dish)^［12］，这种方法比前两者操作更简便，未标记红细胞的非特异结合水平很低。

2生物素标记法的可行性

人们不禁会有许多疑问，为什么要使用NHS-Biotin作为标记物?标记后的红细胞重新注入体内后是否与未标记红细胞具有相同的生存能力，是否一进入体内就会被体内的免疫系统消除?体外分离的红细胞中是否会有较多的示标记红细胞的“污染”?各国学者对此进行了深入的研究。

2.1生物素作为标记物的可行性(suitability of biotin as labeling substance)

在不同的生物和分析系统中，avidin-biotin复合物已经成为非常有用的中介物^［13］，其原因可归纳为：(1)avidin和biotin之间非常强的亲合力(10¹⁵M^-1)，使有极端条件下可保证稳定连接：(2)可以将biotin连接到许多探针或配体上，而不改变它们的生物活性和生理特性；(3)存在许多商品化的生物素化药品以及含avidin的探针。就本方法来讲，不仅可以用覆盖avidin的珠分离标记红细胞^［2］，也可用FITC-avidin(荧光标记物)来检测标记红细胞，并用流式细胞计(flow cytometry)进行定量分析^［10,12］。从实验中可以看到，虽然标记100天或60天后全血中的标记红细胞的个数已经很派，但是由于流式细胞计或FACS可分析记录单个细胞，即使荧光强度的测量值到后期已经很低，FACS仍能可靠地将标记红细胞和未标记红细胞区分开来^［7］。

Magnani M.等^［14］用NHS-Biotin(与红细胞膜蛋白的氨基结合)和biotin hydrazide(可引起红细胞膜的酰基氧化)使红细胞生物素化。通过比较发现，用NHS-Biotin进行标记具有更高的体外恢复率(＞90%)，并在循环中24小时不受损害。相反，biotin hydrazide标记的细胞恢复率仅为5-30%，24小时内几乎消失。此外，在biotin的NHS衍生物中还有一种NHS-LC-biotin(sulphosuccinimidyl-6-(biotinamido)-hexanoate，具有2.2nm的臂，溶于水，结合于膜蛋白)。在体外实验中，这种衍生物细胞恢复率和每个细胞结合的分子数方面近似于或好于NHS-Biotin，而在体内实验中，它虽然具有24小时的循环生存时间，但几天后带有长臂的NHS-biotin就会丢失，这可能是由于血浆中的biotinidase造成的。Cavill等^［15］和Hudson等^［16］也同样发现用NHS-LC-biotin标记的红细胞在成人体内7天后消失和在婴儿体内3-4周后消失 。Hoffmann-Fezer等^［10］使用了NHS-LC-biotin、溶于水的NHS-Biotin(Bxbiotin-WS)和溶于脂的Bxbiotin作为标记物，发现在体外，前两者都能很好地标记红细胞，但在体内仅4周后，它们标记的红细胞都成了未标记红细胞。Hoffmann-Fezer等^［9］还使用自己合成的C-BNHS(Caproylamidobiotin-N-hydroxysuccinimide)进行标记，实验表明它与NHS-Biotin具有同样的效果。他们认为商品化的NHS-Biotin纯度不高，用于大型实验较昂贵，而合成的C-BNHS的产量较高，与红细胞孵育后不会引起大量红细胞的棘化，所以使用C-BNHS较好。但是同样由于NHS-Biotin的商品化，以及它在体内不会出现再利用的现象^［2,10］目前仍常使用NHS-Biotin。

2.2溶剂的毒性(solvenn toxicity)

由于NHS-Biotin是脂溶性物质，只能用脂类物质来溶解，从而不可避免地带来了在标记过程中脂类物质对红细胞及动物体的毒副作用。在体外标记实验中，常用DMF(N.N-Dimethyl-formamide)来作为溶剂^［2,7,10］。DMF的毒性通过测量清洗标记红细胞后的上清液中DMF的浓度来确定。Hoffmann-Fezer等^［7］用气相色谱法测得上清液中DMF浓度远远低于由生理毒性动力模型计算的工作场所暴露在10ppmDMF气体中的剂量，因此，用DMF溶解NHS-Biotin标记红细胞并经过清洗后，再将红细胞注入动物体内，不会发生危险。在体内标记实验中，常用DMSO(Dimethyl sulfoxide)和DMA(Dimethylacetamide)^［6,8］，虽然DMSO的毒性被描述过(狗LD₅₀=2.5g/kg)，但它与DMA相比毒性较低，而且作为NHS-Biotin的溶剂效果更好。在实验中，通常给动物注射atropine sulfate来<