摘要采用静置贴壁细胞培养法，体外长期培养了胎儿、儿童、成人骨髓基质细胞，时间为6个月，可传至10代，并观察了成纤维肌样细胞、内皮细胞和巨噬细胞；通过免疫细胞化学染色法，证明了1～3代的骨髓基质肌样细胞Viementin为阳性，第Ⅷ因子阴性；采用流式细胞仪检测法，证明了儿童骨髓基质细胞的细胞表型为CD^-₃₃、CD^-₃₄、CD^-₃₈、CD⁺_W90,成人骨髓基质细胞为CD^-₃₃、CD^-₃₄、CD⁺₃₈、CD⁺_W90。

采用体外培养和扩增的脐血造血干细胞的半固体集落形成法，证明了基质细胞能长期维持脐血中的LTC-IC的生存，若加入IL-6、IL-3、SCF细胞因子的扩增体系，基质细胞对长期维持和扩增LTC-IC的效果更为明显(P＜0.01)，比无基质细胞的对照组所形成的LTC-IC产率高于2～4倍。表明骨髓基质细胞具有支持造血功能。

中图分类号R239.2⁺8

THE STUDY ON BIOLOGIC CHARACTERISTICS OF HUMAN BONE MARROW

STROMAL CELLS INCLUDING THE HEMATOPOIESIS SUPPORTED FUNCTION

Yang Ji-chengSheng Wei-HuaLi Li-e

(Gene engineering research unit of Suzhou Medecal college, 215007)

AbstractFetal, child, adult bone marrow stomal cells were cultured for six months in vitro by static adherent assay, and propagated up to 10 times, The myoid fibroblast, endothelial and macrophagic cells were observed. The result of immunocyte chemisty intricated the myoid cells propagated 1 to 3 times were positive for viementin and negtive for Ⅷ factor. The result of phenotype analysis by FACS suggested the child bone marrow stromal cells were CD^-₃₃、CD^-₃₄、CD^-₃₈、CD⁺_W90，and adult cells were CD^-₃₃、CD^-₃₄、CD⁺₃₈、CD⁺_W90。

The CFC assay was used to test the hematopoietic in cord bleed after culture and expansion in vitro, the result demonstrated the long-term supportive effect of stromal cells on the survival of LTC-ICs in cord blood. The expansion of LTC-ICs in the stromal-supported system containing SCF, IL_-3,IL_-6 was more remarkable than that in nonstroma system (P＜0.01). The frequency of LTC-ICs of the stromal-supported system was 2 to 4 times higher than that of nonstroma system. The results above suggested that the bone marrow stromal cells have bone marrow hematopoiesis-supported function.

Keywords Human bone marrow stromal cellsLong-term cultrue-initiating cells (LTC-ICs) Fibroblast Hematopoiesis-supported function

人骨髓基质细胞包括成纤维细胞，内皮细胞，脂肪细胞和巨噬细胞。在体内可提供造血微环境^［1，2］，已成为造血干细胞生长、分化和自我更新的重要场所，这可能与基质细胞能合成和分泌多种调控因子(细胞因子和粘附分子)和基质(胶原和酶等)有关^［3，4］。

国内外近期对人骨髓基质细胞的造血调控的研究已取得了可喜的进展，并探讨了造血基质干细胞对维持造血微环境的作用，为此我们近期对来源于胎儿、儿童和成人骨髓基质细胞进行了体外长期培养，并开展了有关细胞分化表型、造血支持作用等生物学特性的实验研究，现分别报告如下：

1材料

1.1人骨髓基质细胞的组织来源

胎儿骨髓取自于孕早期5～6个月的人工流产的正常胎儿骨髓共3例(由本市第二人民医院妇产科提供)。儿童骨髓取自于骨折后的健康儿童(志愿者)，年龄2～10岁，共3例(由本院附属儿院骨科提供)，成人骨髓取自于骨折后健康成人(志愿者)，年龄20～45岁，共4例(由本院附属一院骨科提供)。

1.2传代细胞系WI-38细胞(人胚肺二倍体成纤维细胞系)，HOS-8603细胞(骨肉瘤细胞系)，3T3细胞(鼠成纤维细胞系)均为本室保存。按常规培养传代。

1.3试剂

①Ficoll淋巴细胞分层液(比重1.077)(上海试剂二厂产)。

②单抗试剂：波形纤维蛋白(Viementin)单抗，结蛋白(Desmin)单抗。α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin)单抗，Ⅷ因子抗原(Von willebrand factor)单抗均为DAKO公司产，ABC标准试剂盒(Vector公司产)，异硫氰荧光素标记的鼠抗人CD₃₄、CD₃₃、CD₃₈、CD_W90单抗(Immunotech公司产)。

③细胞因子：IL-3(中科院刘新恒院士惠赠)，GM-CSF(上海二军大曹雪涛教授惠赠)，IL-2、G-SCF、EPO购自深圳晶美公司。

1.4脐血取足月顺产健康新生儿抗凝脐血(由本市妇保医院提供)。

2方法

2.1人骨髓基质细胞的分离和培养

取骨髓3～5ml，用Ficoll淋巴细胞分层液(比重1.077)分离单核细胞(MNCS)，用无钙、镁PBS洗2次，RPMI₁₆₄₀洗一次后，用含20%小牛血清的RPMI₁₆₄₀培养基静置培养，每隔3～天半量换液一次，换液时将上层悬浮的细胞移入新瓶培养，原瓶培养的原代细胞以Po代表，新瓶中原代细胞为P′o，待贴壁的骨髓基质纤维细胞形成单层后，再进行传代，由Po细胞传代后的各代用P₁(一代)，P₂(二代)，P₃(三代)代表，由P′o细胞传代后的各代用P′₁(一代)，P′₂(二代)，P′₃(三代)代表以此类推。

2.2人骨髓基质细胞的传代培养和维护

用0.25%胰酶蛋白酶及0.02%EDTA消化已形成单层的基质细胞层，制成悬液后再以1∶2分瓶培养(37℃ 5%CO₂)，开始每隔3～4天换液一次，每周可传代一次，当传至5～7代后细胞生长速度明显减慢，改为5天换液一次，2周传代一次，并将胎儿、儿童、成人骨髓基质细胞统一分别用EBMSC、CBMSC、ABMSC表示，C-后面的数字表示所传代次。

2.3免疫细胞化学染色法按常规法先加一抗，结合水洗后，按ABC法说明书进行，经染色、透明、封片后镜检。用3T3细胞株来作Viementin表达阳性的细胞对照，阴性对照用PBS替代一抗。

2.4流式细胞仪检测法按常规操作程序进行。

2.5人骨髓基质细胞对脐血造血细胞的支持效应。

2.5.1人骨髓基质细胞体外维持脐血造血干细胞试验

附图人骨髓基质细胞体外维持和扩增脐血造血干细胞试验的流程

2.5.2半固体混合集落(CFU-Mix)形成试验

收集培养至2周、4周、6周的造血和基质细胞，经洗涤后接种含有1.3%甲基纤维素(Sigma产)的IMDA培养体系(含20%FCS，氢考、双抗、SCF50ng/ml、IL_-3、IL_-6为25ng/ml，GM-CSF为40ng/ml，EPO为2u/ml)在24孔板中于37℃,5%CO₂，培养2～3周，计数混合集落数(CFU-Mix)即为集落形成细胞(Colony-forming、cells,CFC)的总数和长期培养5～6周生成的长期培养起始细胞ITC-IC(long-term culture-initiating cells)的数量，并采用双因素比较行t检验。

2.5.3人骨髓基质细胞IL_-6诱生试验

用IL_-3(10ng/ml)和LPS(北京帮定)10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml刺激成人骨髓基质细胞，24小时后收获上清，并设有无任何因子刺激的常规培养对照组，采用IL_-6依赖的B₉细胞，经微量细胞增殖的MTT法测定上清中IL_-6效价(IU/ml)，并进行双因素比较行t检验。

3结果

3.1各种人骨髓基质细胞分离和体外传代培养结果

人骨髓基质细胞贴壁生长，一周后有大量成纤维细胞贴壁，并有集落产生，呈岛状。经换液培养于2周左右方可形成单层；每次换液时，收集悬浮细胞移入新瓶继续静置培养，仍有许多贴壁细胞生长。再次移瓶培养可见有单核巨噬细胞贴壁生长，此细胞虽不能分裂和传代培养，但可持续存活2个月。在纤维细胞消化传代中，发现当纤维细胞完全脱落时，瓶壁上仍贴有未消化下来的内皮细胞，经充分消化和洗涤，又可将骨髓基质中的纤维细胞和内皮细胞分离开来，这样既可获得较纯的纤维细胞，又可获得较纯的内皮细胞，经镜检，成纤维细胞形体大