【摘要】目的了解三氧化二砷（As₂O₃）对HL-60细胞及NB4细胞端粒酶活性的调节作用。方法利用透射电镜、流式细胞仪、半定量端粒重复扩增-银染色等手段，检测细胞的分化、凋亡，bcl-2表达及端粒酶活性。结果低浓度As₂O₃对HL-60及NB4细胞的诱导分化作用不及全反式维甲酸（ATRA），但对其端粒酶活性的下调作用却比ATRA强烈和迅速。较高浓度As₂O₃在有效诱导两种细胞凋亡过程中，伴随端粒酶活性更迅速的下调，同时bcl-2表达水平也显著下降。As₂O₃及ATRA对端粒酶活性均无直接的抑制作用。结论低浓度As₂O₃对HL-60细胞及NB4细胞端粒酶活性的下调是分化和凋亡作用的叠加。白血病细胞的凋亡与其端粒酶活性调节之间存在相似或相关的调控体系，其中bcl-2可能起着重要作用。

Regulation of telomerase activity in HL-60 and NB4 cells by arsenic trioxide

CHEN Feng, XU Gongli, LI Ying, et al.

（Department of Hematology, Affiliated Hospital of Shandong Medical University, Jinan250012，China）

【Abstract】ObjectiveTo investigate the regulation of telomerase activity in HL-60 and NB4 cells exposed to arsenic trioxide (As₂O₃). Methods Cell morphology, intracellular DNA distribution, bcl-2 expression and telomerase activity were evaluated in HL-60 and NB4 cells exposed to As₂O₃ or ATRA. ResultsThe differentiation induction of HL-60 and NB4 cells by low concentration of As₂O₃ was weaker than that by ATRA, but downregulation effect of As₂O₃ on telomerase activity was more strong and quick. Higher concentration of As₂O₃ induced apoptosis in HL-60 or NB4 cells accompanied by more rapid down regulation of telomerase activity and bcl-2 expression. Neither As₂O₃ nor ATRA showed direct inhibition effect on telomerase activity. ConclusionThe downregulation of telomerase activity by low concentration of As₂O₃ in HL-60 and NB4 cells is the result of overlap of differentiation and apoptosis. There are similar mechanisms in the regulation of telomerase activity and apoptosis in different leukemia cells. Bcl-2 may play an important role in these mechanisms.

【Key words】Arsenicals；Telomere, terminal transferase;Leukemia, myeloblastic, acute；Cell differentiation；Apoptosis

近年来提出的端粒-端粒酶假说认为端粒酶的活化是绝大多数肿瘤发生的终末共同通路^［1］。1995年Sharma等^［2］首次报道白血病细胞的诱导分化与其端粒酶活性调节之间存在密切联系。细胞凋亡与端粒酶活性之间是否存在某种联系，迄今仍罕见报道。近年来，三氧化二砷(As₂O₃)对白血病的治疗作用已引起广泛关注，该药物通过诱导白血病细胞分化及凋亡两条途径发挥其治疗作用^［3］。我们选择人白血病细胞株HL-60及NB4细胞为模型，就As₂O₃诱导分化及凋亡时对其端粒酶活性的影响及作用机制进行了初步的探讨。

材料和方法

1制剂As₂O₃（Sigma公司产品）以1ml 生理盐水溶解后，用RPMI1640配制成浓度为10^-3mol/L的储存液。全反式维甲酸(ATRA，Sigma公司产品）以无水乙醇配制成浓度为10^-2mol/L的储存液。使用前稀释至所需浓度。

2 细胞培养HL-60细胞为本室冻存，NB4细胞引自上海第二医科大学、上海血液学研究所。二者均以2×10⁵/ml 的浓度接种于含或不含上述药物的新鲜RPMI 1640培养液（内含体积分数为10%的小牛血清、100U/ml青霉素、10μg/ml链霉素）中常规培养。实验时，收集细胞，锥虫蓝(台盼蓝)拒染法计数活细胞。

3细胞形态观察收集细胞并滴片，干燥后经Wright-Giemsa染色，光镜下观察。同时取上述细胞1×10⁶个，磷酸缓冲液（PBS）洗涤后，按常规电镜样品制备程序切片，透射电镜下观察。

4 细胞表面分化抗原检测取1×10⁶细胞，PBS洗涤后加入20μl鼠抗人CD_11b-PE或CD₃₃-FITC单克隆抗体（PharMingen公司产品），室温下避光孵育30min，PBS洗涤，弃上清，加入0.5ml PBS悬浮细胞，流式细胞仪（BD公司产品）测定，以IgG₁-FITC作为阴性对照。

5流式细胞仪检测细胞DNA含量分布用PBS洗涤细胞2次，加入体积分数为70%的冷乙醇固定24h（4℃）。洗涤细胞，与含10μg/ml RNA酶的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）共同孵育（37℃）30min。然后用碘化丙锭（50μg/ml）进行细胞DNA染色。用流式细胞仪分析细胞DNA含量分布。资料均经ModFitLT软件收集、储存和分析。

6bcl-2检测取细胞1×10⁶，PBS洗涤后加鼠抗人bcl-2-FITC 20μl，室温下避光孵育30min，PBS洗涤，弃上清，加0.5ml PBS悬浮细胞，用流式细胞仪测定。资料均经CELLQuest软件收集、储存和分析。

7 端粒酶活性检测及半定量分析采用端粒重复扩增（TRAP）-银染色。由山东医科大学遗传学教研室提供端粒酶活性检测试剂盒，按说明书操作并加以改进。每次实验均取2000个细胞参加TRAP反应（此时Taq酶活性不受抑制且电泳图像也比较理想），每组实验均同时设阳性对照（未经药物处理的HL-60或NB4细胞）及阴性对照（灭活RNA酶）各一，并重复实验4次。电泳结果均经Smart View生物电泳图像分析系统（上海复日科技有限公司产品）扫描并存储图像。因端粒酶活性的强弱表现为间隔6bp梯状条带数目及辉度的不同，故我们采用各泳道的辉度减去阴性对照的辉度后，与阳性对照的辉度（其活性设为100）相比较，所得的比值作为端粒酶活性的相对值。

8统计学分析双变量相关性研究采用多因素分析的对数曲线拟合法，两两比较采用t检验。

结果

1As₂O₃与ATRA对HL-60及NB4细胞的诱导分化及对其端粒酶活性调节作用的比较1.0μmol/L As₂O₃对HL-60细胞具有一定的诱导分化作用，表现为细胞核缩小，染色质浓缩，胞浆嗜碱性减弱，细胞表面分化抗原CD_11b逐渐上升而CD₃₃下降。但相同浓度的As₂O₃对HL-60细胞诱导分化作用的强度不如ATRA，成熟细胞形态出现较晚且比例相对较少，CD_11b及CD₃₃的调变幅度也不及ATRA。0.1μmol/L As₂O₃对NB4细胞也具有一定的诱导分化作用，其细胞形态及表面分化抗原的调变作用类似HL-60细胞，与相同浓度ATRA相比，As₂O₃对NB4细胞的诱导分化作用强度及细胞表面分化抗原的调变幅度亦不如ATRA。

As₂O₃诱导两种细胞分化过程中也伴随端粒酶活性的下调，作用24h时酶活性已显著受抑，48h基本变为阴性。相同浓度的ATRA作用于两种细胞后，24h端粒酶活性仅略有下降，48～72h显著下降，96～144h基本变为阴性（图1，2）。

图1As₂O₃与ATRA对HL-60细胞端粒酶活性调节作用的比较

图2As₂O₃与ATRA对NB4细胞端粒酶活性调节作用的比较

2ATRA作用后相对端粒酶活性与细胞分化比例的相关性分析以CD_11b表达率代表细胞分化比例，绘制散点图，发现相对端粒酶活性（Y）与CD_11b表达率（X）呈对数相关关系。通过最小二乘法求得其拟合对数曲线方程，HL-60细胞为Y=0.46－49.32 lgX，NB4细胞为 Y=2.00－44.79 lgX。

3As₂O₃对HL-60及NB4细胞的诱导凋亡作用及对其端粒酶活性的调节作用5.0μmol/L As₂O₃对HL-60细胞，1.0μmol/L As₂O₃对NB4细胞均具有显著的诱导凋亡作用，药物作用24h即呈现典型的凋亡形态学改变。流式细胞仪分析DNA含量分布，显示典型的凋亡细胞群，即出现DNA含量明显低于G₁期的亚G₁期细胞峰。

As₂O₃诱导两种细胞凋亡的同时伴随端粒酶活性下调，作用8～12h酶活性即显著受抑，20～24h基本变为阴性（图3，4）。