【摘要】目的研究巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1α)、血小板第4因子(PF4)及二者联合对造血干细胞化疗药物损伤的保护效应及其分子机制。方法将骨髓、脐血单个核细胞及白血病细胞株HL-60分别予MIP-1α、PF4、MIP-1α+PF4、PBS预处理48h，再经柔红霉素（DNR）孵育24h后，用锥虫蓝(台盼蓝)拒染法测细胞活性，用流式细胞仪测细胞周期及CD₃₄⁺CD₃₈^-细胞含量，细胞集落培养、免疫化学法测细胞P16、P27蛋白。结果经MIP-1α及PF4预处理的骨髓和脐血单个核细胞，细胞活性、CD₃₄^＋CD₃₈^-细胞、集落形成能力均比对照组显著增加(P＜0.05)。MIP-1α、PF4组正常脐血及骨髓细胞S+G₂期百分率低于对照组(P＜0.05)。MIP-1α可上调细胞周期调控蛋白P16表达。PF4对P16、P27表达无影响。MIP-1α的保护作用强于PF4，但两者无协同效应。HL-60细胞P16、P27蛋白表达、细胞周期、细胞活性均不受MIP-1α、PF4的影响。结论造血负调控因子MIP-1α、PF4能可逆性、选择性地保护正常造血细胞免受化疗药损伤，MIP-1α通过上调造血祖细胞G₁-S期调控基因p16表达，使细胞阻滞于G₀期，提高细胞对周期特异性化疗药的耐受性。

Protection of hematopoietic stem cells by MIP-1α and PF4 against the cytotoxicity of chemotherapeutic agents

HUANG Ke, HUANG Shaoliang, PAN Jingxuan, et al.

（Pediatric Department, Sun Yat-sen Memorial Hospital of Zhongshan Medical University, Guangzhou510120，China）

【Abstract】ObjectiveTo study the protective effects of macrophage inflammatory protein-1α(MIP-1α) and platelet factor 4(PF4), alone and in combination, on hematopoietic stem/progenitor cells against the cytotoxicity of chemotherapeutic drugs. MethodsBone marrow and cord blood mononuclear cells(BMMNC and CBMNC) and HL-60 cells were pretreated with MIP-1α, PF4, MIP-1α+ PF4,and PBS respectively for 48 hours, and then incubated with DNR for an additional 24 hours. Cell viability, cell cycle, CD₃₄⁺ CD₃₈^- cells, colony forming units(CFU) and protein expression of p16， p27 gene were measured. Results①Cell viability, the number of CD₃₄⁺ CD₃₈^- cells and CFU yields of BMMNC and CBMNC in MIP-1α and PF4 groups were significantly higher than that in control groups(P＜0.05). ②Cells in S+G₂ phase in MIP-1αand PF4 groups were significantly fewer than that in control groups(P＜0.05). ③MIP-1α upregulated the expression of p16 gene of stem/progenitor cells. PF4 showed no effects on expression of both p16 and p27 genes. ④Hematopoietic protection of MIP-1α was stronger than that of PF4. No cooperative effect could be seen in combination of the two agents.⑤Cell viability, cell cycle and expression of p16 and p27 gene of HL-60 cells were not affected by either MIP-1α or PF4. ConclusionMIP-1α and PF4 can reversibly and selectively protect hematopoietic stem/progenitor cells against cytotoxicity of chemotherapeutic agents. MIP-1α can suppress cell proliferation by upregulating the expression of p16 gene and block the cell cycle at G₀ phase, resulting in the elevation of cell resistance to chemotherapeutic drugs.

【Key word】Stem cell factor;Hematopoietic stem cell;Macrophage inflammatory protein-1；Platelet factor 4;Protein p16;Protein p27

骨髓造血抑制是肿瘤患者化疗过程中常见的并发症。近年来研究发现，血小板第4因子（PF4）、巨噬细胞炎性蛋白（MIP-1α）等造血负调控因子对骨髓造血祖细胞化疗药物损伤具有保护作用，能选择性、可逆性地阻止正常造血祖细胞于静止期，提高细胞对周期特异性药物的耐受性^［1，2］。但是，造血负调控因子作用的分子机制目前不十分清楚。我们比较了 MIP-1α、PF4单独与联合应用对骨髓造血细胞柔红霉素（DNR）损伤的保护效应及其分子机制，为其进入临床应用提供一定的理论与实验依据。

材料和方法

1实验材料

1.1骨髓及脐血单个核细胞（MNC）悬液的制备：骨髓标本13份来自本院儿科住院患儿，其中白血病完全缓解期6例，地中海贫血1例，特发性血小板减少性紫癜2例，淋巴瘤未侵犯骨髓4例。每例抽取骨髓3 ml。脐血标本10份，来自本院产房足月顺产新生儿，母婴均无疾病。每份脐血以肝素抗凝，留取脐血15ml。于24h内骨髓及脐血分别经Ficoll分离液分离有核细胞，再经RPMI 1640培养液洗涤2次，将沉淀细胞加入含体积分数为10%胎牛血清（FCS）的RPMI 1640培养液中，充分混匀，制成细胞悬液，计数有核细胞。细胞终浓度2×10⁶/ml，细胞存活率95%以上，培养24h后备用。

1.2HL-60细胞株：将复苏后的HL-60细胞（中山医科大学肿瘤研究所提供）悬浮于含体积分数为10% FCS的RPMI 1640培养液并移至培养瓶中培养，2～3d传代1次，细胞浓度2×10⁶/ml。细胞存活率95%以上。

2实验方法实验分4组，分别为 MIP-1α组［加入MIP-1α（美国Peprotech公司产品）100ng/ml。因其半衰期短，需每天加药］、PF4组［加入PF4（法国贝特公司）5μg/ml］、PF4+ MIP-1α联合组（剂量同前）及空白对照组（仅加PBS）。HL-60细胞株作为对照组。以上各组设3个复孔，每孔含细胞数1×10⁶ml，培养48h，每组取1孔细胞测细胞周期及P16、P27蛋白表达，剩下每孔细胞加DNR（1mg/ml）培养24h，取细胞洗涤后作活性检测、造血祖细胞集落培养及CD₃₄⁺CD₃₈^-细胞含量的测定。未经因子或PBS预处理且不接受DNR孵育的细胞定为预处理前细胞。

2.1锥虫蓝(台盼蓝)拒染法检测细胞活性：以40g/L锥虫蓝染色细胞，30s～1min后计算细胞拒染率，即为细胞存活率。

2.2流式细胞仪(FACS)测CD₃₄⁺CD₃₈^-细胞含量：每份样品MNC≥5×10⁴，标记抗体（DaK0公司）为PE结合的CD₃₄抗体和FITC标记的CD₃₈抗体，对照为IgG₁-PE和IgG₁-FITC。根据PE和FITC的荧光激发特性进行双标记参数分析。所用FACS为美国COULTER公司ELITE型，波长488nm。

2.3体外造血祖细胞集落培养：按本室常规法^［3］进行粒-巨噬细胞系集落形成单位（CFU-GM）及混合集落形成单位（CFU-MIX）培养。第7～14天在倒置显微镜下计数CFU-GM，第14～28天计数CFU-MIX。40个以上细胞组成的细胞团为一个集落，CFU-MIX为集落内含红细胞及巨核样细胞、粒系细胞、巨噬细胞成分。瑞氏-姬姆萨染色确定细胞类型并摄片。

2.4FACS检测细胞增殖周期（S+G₂）：各实验组细胞培养48h，培养液洗涤后调整细胞浓度≥10⁵/ml，以体积分数为70%的乙醇固定过夜（4℃），FACS测出细胞各周期的DNA相对含量和百分率。

2.5免疫组织化学法检测P16、P27蛋白的表达：骨髓及HL-60各组细胞经PBS洗涤，取细胞离心涂片待干燥，甲醛固定，采用ABC法（中山生物试剂公司ABC免疫试剂盒，P16、P27鼠抗人单抗为美国Neomarker公司产品）进行免疫组织化学染色。两种蛋白均在细胞浆及细胞核中表达，胞浆、胞核见弥漫散在棕色颗粒为阳性表达。根据染色强度评分：无显色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。每片计数200个细胞，根据染色强度及阳性细胞数计算染色系数，对结果进行半定量。染色系数=染色强度×染色细胞百分率。

3统计学分析本实验资料均以±s表示，多组间比较采用随机区组方差分析（Two-way ANOVA）及多个样本均数两两比较q检验（Newman-Keuls法）。

结果

1MIP-1α及PF4对骨髓及脐血MNC存活率的影响新鲜骨髓及脐血MNC锥虫蓝拒染率＞95%。MIP-1α、PF4、MIP-1α+PF4组及空白对照组的骨髓、脐血MNC孵育48h后，分别加入DNR再孵育24h，结果加因子组MNC存活率均明显高于空白对照组（P值均＜0.05），骨髓MNC分别为（79.0±6.0）%，（74.0±9.0)%，（79.0±6.0）%及（48.0±14.0）%，脐血MNC分别为（79.9±5.7）%，（78.2±4.7）%，（77.0±5.4）%，（59.6±8.3）%，加因子各组间差异均无显著性，MIP-1α与PF4相加并无协同作用。HL-60细胞各组存活率分别为（28.0±7.0）%，（30.0±5.0）%，（25.0±6.0）%，（35.0±9.0）%，组间差异无显著性（P＞0.05），均比骨髓及脐血MNC存活率低（P值均＜0.05）。

2MIP-1α及PF4对骨髓及脐血造血细胞集落形成的影响由表1，2可见MIP-1α及PF4负调控因子对造血祖细胞集落生长有明显影响，加负调控因子各