造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是最早、也是公认为最理想的基因治疗靶细胞之一。基因治疗临床方案近三分之一涉及到HSC^［1］。主要基于以下几方面的原因：①造血干细胞是一种“永生性”细胞；②造血干细胞具有很强的增殖、分化与自我更新能力；③造血干细胞及其子代细胞直接与血液相接触，或存在于血液循环之中，极利于转染细胞的表达产物释放入血液；④HSC从采集、分离到体外培养、扩增以及自体或异体移植等已具备一套成熟的技术路线，并已为临床所普遍应用。从而为HSC基因治疗奠定了极好的细胞移植学基础。如果能将HSC基因治疗与HSC移植很好地结合起来，有望为人类疾病的治疗提供一种全新的手段和理想模式。然而，由于目前载体系统的缺陷，HSC基因治疗仍存在许多问题有待克服。这些问题的解决将取决于基因转移系统的进一步改进，新型载体系统的开发以及人们对于HSC细胞生物学本质的进一步阐明。

1逆转录病毒介导的HSC基因治疗逆转录病毒载体(Retrovirus vector,RV)仍是目前用于HSC基因治疗最多的一个系统。早期研究显示，利用RV介导在小鼠HSC可获得20%～30%的基因转移率。然而，在大动物及人类试验中，RV介导HSC的基因转移率仅为1%～2%，甚到低至0.1%～1%^［2］。因此，对于RV介导的HSC基因治疗而言，最大的问题便是基因转导效率低下。为何RV介导HSC的基因转移率如此之低?而且，在小鼠与人之间的差异又如此之大呢?当然，原因是复杂的。一方面因为RV只能在细胞处于分裂期，核膜破裂时才能进入核内。而对处在非分裂期，核膜完整的细胞，RV则不能有效地进入其细胞核。然而，在正常情况下，人体95%的HSC均处于非分裂状态的G₀/G₁期。因此，RV不能有效地进入人HSC的细胞核。而在小动物，比如小鼠，其HSC的周期状态以及其HSC表面的受体密度与人类及大动物存在的差异可能较利于RV的进入。在人类HSC体外培养体系中应用刺激因子虽可促进干细胞进入细胞周期状态，但体外扩增难以完全模拟体内环境，经过一段时间的培养，HSC便丧失了干细胞的特征，即成为祖细胞或更晚期的细胞了。那么，能否让HSC进入细胞周期，而又不分化为晚期呢?可以说，这是目前HSC研究所面临的最大的细胞生物学难题之一。目前的对策仅仅是在以下方面作一些探索，①调整培养体系。使用哪些细胞因子来进行体外处理、以怎样的比例进行组合等，目前尚未得出一致的结论。②缩短细胞体外处理时间。采用短期培养方案，以使得HSC不足以有充分的机会进行增殖、分化。③应用骨髓基质支持培养体系模拟体内环境。比如，采用HSC与间质细胞共培养，以使得HSC进入细胞周期后不是进行增殖，而是在体外进行自我更新。这也许是最理想的结果，既增加了细胞的数量，又保持了干细胞的本质特点。事实上，目前还不可能做到这一点。④探讨新的促分化抑制剂，以阻止HSC向晚期细胞的分化。比如，应用抗TGF-β抗体，以抑制TGF-β对HSC的促分化作用。另外的方法是采用骨髓替代途径的干细胞来源。比如开发脐带血干细胞和经动员的外周血干细胞^［3］。据观察发现，RV介导脐血干细胞的基因转移率比骨髓干细胞高。正是因为脐血干细胞更多地处于细胞周期之中。

另一方面，RV介导HSC基因转移是受体介导的。然而，在正常情况下人体HSC表面的RV受体分布较少^［4］，不利于RV的进入。目前，人们正试图通过刺激RV受体的表达来增加HSC的基因转移率。当然，影响RV介导HSC基因转移率的因素很多。比如，RV在37?℃时的胞外半衰期很短。而病毒颗粒在培养体系中的活动能力不强。由于干细胞数量少，在转导体系中，RV与HSC相互碰撞的机率不高，也影响了基因转移率。为此，曾有研究者试图利用离心的办法来增加RV与HSC之间的接触。但离心会导致干细胞的损伤。亦有人采用转动的方式进行RV介导HSC的基因转移试验，或者在病毒液中加入纤维连接素(fibronection),使病毒颗粒更易于接触到干细胞表面。从而，提高其基因转移率。近年来，也有通过假病毒途径，比如利用长臂猿白血病病毒(GALV)的包装蛋白来包装RV，制备假病毒载体^［5］，从而提高RV介导的基因转移率。

此外，由于RV曾有导致黑猩猩恶性T细胞淋巴瘤的报道，因此，不可能直接用于人体体内试验。这也是RV介导HSC基因治疗的又一大问题，即安全性问题。目前，RV介导基因治疗一般采用ex vivo途径，以便及时发现并去除可能出现的突变细胞，以确保基因治疗的安全性。然而，所有这些策略都未从根本上解决问题。因此，不少研究人员已把目光转向开发其它的基因转移系统。希望能找到一个更适合于HSC基因转移的理想体系。

2腺相关病毒介导的HSC基因治疗如上所述，RV在介导HSC基因转移方面存在许多难以克服的缺陷。为此，一些研究人员把注意力转向腺相关病毒载体(Adeno-associated virus vector,AAV)，以探讨该基因转移系统介导HSC基因治疗的可能性。AAV是一种人类细小病毒，它最初是在腺病毒流行期间作为一个共感染因子被人们发现的。AAV本身没有任何显著的致病作用。到目前为止，尚未发现任何由AAV所致的人类疾病。因此，AAV被认为是一种用于人类基因治疗很有前途的安全载体。与RV相比，AAV的最大优势在于其可感染分裂或非分裂细胞，如HSC、肝细胞以及终未细胞，如肌细胞、上皮细胞等，同时，它还具有多方面的特点，比如，①无致病性；②低免疫原性；③可整合或定点整合；④宿主范围广等^［6］。

目前，以AAV作载体所进行的基因治疗研究可谓是方兴未艾。美国费城儿童医院与Avigen公司合作，已申请AAV介导血友病B基因治疗临床试验。然而，作为一个基因转移系统，与RV相比AAV载体系统还显“年轻”。同样，还有许多问题有待克服。这些问题表现在：①制备困难，尤其是大量制备。经典的rAAV制备方法不仅仅需要辅助质粒提供反式蛋白，而且还需要辅助病毒，如Ad或HSV的存在，以辅助其复制，费时、费力，而且病毒粒子的产量很低，难以满足临床及大动物实验所需。目前，许多实验正试图通过杂合病毒系统，比如AAV/HSV杂合病毒的应用来解决这一问题。②定点整合特征的丧失。野生型AAV可特异地定点整合于人的19号染色体。然而，重组AAV往往丧失这一特征。这将导致因随机整合所带来的基因治疗危险性的增加。近来，人们正致力于恢复AAV定点整合的能力，以确保其安全性^［7］。③靶向性问题。AAV载体的宿主范围很广，这是优点。反过来讲，这又导致了该载体靶向性方面的缺陷。目前应用得最多的AAV转导细胞是肌细胞。但有研究者观察到AAV在肌肉细胞中可能不发生整合，而是在细胞核内以一种AAV与染色质紧密结合的方式存在，其次是以肝细胞作为靶细胞所进行的探讨。然而，由于制备困难，体内应用常难以获得足够数量的转染细胞数。因此，在大动物应用后目的基因在体内的总体表达水平仍很低，难以满足临床治疗的需要。由于HSC独具魅力的增殖、分化潜能以及其成熟的体外培养与移植技术，自然会被不少研究者所看好。因此，早已有人利用AAV进行HSC基因转移的探索。遗憾的是，AAV介导HSC基因转移的效率并不十分理想，而且在不同个体之间差异很大^［8］。现已证实AAV不能感染巨核细胞系。近来有研究试图通过对AAV Cap包装蛋白进行改造，即将Kit受体配基序列嵌合于Cap蛋白之中，以增加AAV与HSC的特异性结合能力^［9］，但其结果同样并不令人满意。有关AAV分子病毒学的研究显示，AAV对细胞的进入也是受体介导的，而且，涉及到两步受体介导过程。即基础受体(primary receptor)，如柯萨奇腺病毒受体、HSPG受体和共受体(coreceptor)，如αV整合素、HVEM以及FGFR1受体等。有研究证实，如果细胞表面仅表达基础受体，如HSPG，而无共受体表达，则不能导致AAV的有效感染^［10］。可见，AAV介导进入细胞的机制十分复杂。同时，AAV载体的包装蛋白亦很难进行改造。也许，真正的出路是另辟蹊径寻找其它新的途径，比如假病毒途径。目前，我所正在进行AAV/SV40假病毒介导HSC基因转移的研究工作。其中部分原因即在于利用SV40对HSC的高效感染性。

3SV40介导的HSC基因治疗SV40是乳多空病毒属的一种，为大约5.2kb大小的双链DNA病毒。SV40对人体无害。50年代，在美国曾发生一起脊髓灰质炎疫苗被SV40病毒污染而误用于人体的事件。当时，约几百万不同年龄的人群接受这种被污染疫苗的接种。所幸的是，未发生一起因SV40病毒感染所致的疾病。临床上也未发现任何与SV40有关的病例报道。因此，也被作为一种基因治疗的载体而被人们所应用。早在80年代就有利用SV40介导骨髓细胞基因转移的研究报道，但早期SV40载体的制备过程中野生病毒污染严重，野生病毒的污染率高达90%，无法用于人体^［11］，制约了SV40载体的应用。近年来Oppenheim等^［12］在SV40载体制备方面做了大量的工作。他们发现SV40包装蛋白具有许多独特的包装特点，不仅可包装含有小至150?bp SV40序列的基因片段，而且还可在试管内于控制条件下，由昆虫细胞系统提供包装蛋白来包装由Ecoli制备的质粒DNA，从而制备出SV40假病毒粒子。这一体外包装技术的出现为人类充分利用病毒的特点，包装出具有非病毒意义的安全的基因治疗载体提供了可能。这一工作才刚刚开始，还有许多问题有待解决，首先必须纯化由昆虫系统提供的包装蛋白提取物，以便更准确地进行包装及调控；其次就是进一步增加包装效率，以达到大量制备的目的。

SV40载体对HSC具有极高的感染率，有报道可高达95%^［13］，这是目前其它载体所不能比拟的。而且转导过程简单、快速。体内回输后在外周血循环中可检测到大约20%～30%的转染细胞阳性率。如果解决制备、野生病毒污染及整合等问题，SV40用于HSC基因治疗将是极有前途的。

4慢病毒载体介导的H