【摘要】目的探讨儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）患者在初诊、完全缓解(CR)及复发不同时期的T细胞受体(TCR)δV-D、γV-J基因重排连接区序列的差异及其意义。方法采用T-载体分子克隆测序、限制性酶切及聚合酶链反应等技术，对34份ALL患者标本进行TCR δ、γ连接区序列动态分析。结果34份ALL患者标本的TCRδ、γ基因重排序列在初诊、CR及复发不同转归时期显示有差异性和规律性。TCRδV-D重排序列分析显示：24份ALL患者标本中，10份初诊患者Vδ2、Dδ3序列较完整，其中7份伴有Dδ3的九碱基序列区T→C突变。11份CR期患者有明显Vδ2的3′端、Dδ3的5′端及七碱基序列重排序列缺失，Dδ3九碱基序列区T→C突变消失。初诊与CR期ALL患者Vδ2或Dδ3重排序列缺失率及Dδ3九碱基序列区T→C突变率比较，差异均有极显著性意义（精确概率计算，P=0.001, P=0.001）。3份复发患者标本均保留Dδ3的5′端重排序列完整。10份TCRγV-J序列分析结果规律性与δ相似。结论ALL的TCRδV-D 、TCRγV-J基因重排序列的改变与ALL的发生、疗效及转归有着密切的内在联系。

Dynamic analysis of junctional sequences of T cell receptor(TCR) δ and γ gene rearrangement in childhood with acute lymphoblastic leukemia

LU Jie, GU Renkai, LEI Ke, et al.

(Institute of Pediatrics, Affiliated Hospital, Medical School of Qingdao University, Qingdao266003,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the junctional sequence difference of T cell receptor δ and γ gene rearrangement in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL) at diagnosis, complete remission (CR) and relapse. MethodsBy using the T-vector molecular cloning and sequencing and polymerase chain reaction, the junctional sequences of TCRδV-D and TCRγV-J were dynamically analyzed in 34 bone marrow samples of ALL. Results The junctional sequence of TCR δ、γ gene showed significant difference and regularity before and after remission and during relapsed peroids. The sequence of TCR δV-D were analyzed in 24 samples from ALL. Among them, the intact Vδ2 and 5′Dδ3 sequences were observed in 10 samples at diagnosis, of which 7 samples had T→C mutation in Dδ3 nonamer sequence. The deletions of rearranged Vδ2, 5′Dδ3 and Dδ3 haptamer sequences were found in 11 complete remission (CR) samples with ALL, but none had T→C mutation in Dδ3 nonamer sequence. The deletion rate of Vδ2 or Dδ3 sequences and the T→C mutation in Dδ3 nonamer sequence were extremely differed between samples at diagnosis and in remission (calculate exact probabilities P=0.001). The junctional rearrangement sequence of 5′D δ 3 sequences tended to remain intact in 3 relapsed samples. The findings of TCRγV-J sequences were similar to that of TCRδV-D in 10 ALL patients. ConclusionThe difference of TCRδV-D and TCRγV-J junctional sequences were related to the development, therapeutic effectiveness and outcome in ALL.

【Key words】Leukemia, acute;T cell receptor; Molecular cloning; Dynamic sequence analysis

T细胞受体（TCR）的基因重排不仅存在于急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）中，多数B-ALL中也有此重排^［1-5］。我们曾以TCRδ、γ重排为克隆特异性标志，对ALL完全缓解（CR）期患者进行微量残留病（MRD）的定量研究，发现MRD量的变化与ALL化疗的疗效、缓解及复发密切相关。关于ALL不同转归时期TCR重排序列变化的动态研究报道甚少。为探讨儿童ALL在初诊、CR及复发不同时期TCRδ、γ连接区重排序列的差异及其意义，我们对34份ALL患者骨髓标本进行了TCRδV-D和TCRγV-J重排序列动态分析。现将结果报告如下。

病例和方法

1病例经我院儿科诊治的ALL患者27例（34份标本），男17例，女10例，初诊年龄2～11岁，中位年龄6岁。所用34份标本为ALL患者新鲜骨髓液及保存的骨髓涂片，参考Sambrook和Fey等提供的方法^{［ 6，7］}，采用DNA提取试剂盒(Promega公司产品) 提取骨髓DNA，用紫外分光光度计测定DNA纯度及质量浓度。

2聚合酶链反应(PCR)

2.1寡核苷酸引物选择与合成：用于扩增ALL的TCRδ、γ基因重排的特异性寡核苷酸引物^［1］由北京华美生物工程公司合成。

Vδ2：5′-TGGCCCTGGTTTCAAAGACAATTTCCA-3′；

Dδ3：5′-GAGGATATCCCAGGGAAATGGCACTT-3′；

Vγ1：5′-CTACACCAGGAGGGGAAGG-3′；

Jγ12：5′-ATTCTTCCGATACTTACCTGTGA-3′。

2.2PCR条件：经PCR条件优化，在50μl的体系中，加入5μl的10×PCR缓冲液，dNTP200μmol/L，患儿骨髓DNA0.1μg，Mg²⁺终浓度2.5mmol/L，引物终浓度1.0μmol/L 。循环前100℃加热5min，立即将试管置于冰渣中冷却后，加入 Taq酶1.0U。循环条件：TCR δ为95℃变性45s，60℃复性45s, 72℃延伸30s, 30个循环，72℃延伸5min。TCRγ为94℃变性1min，56℃复性1min, 延伸条件及循环次数同TCRδ扩增。

2.3PCR扩增产物经20g/L的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）电泳分离20min，用分子量标记物鉴定扩增产物，同时设阳性及阴性对照。用GDS-UVP8000凝胶成像仪及其分析软件进行吸光度(A)分析并摄影。

3T-载体分子克隆及测序

3.1PCR产物的纯化：用PCR扩增产物纯化试剂盒(Promega公司产品)及其提供的方法,对34份ALL患者标本TCR Vδ2Dδ3和TCR Vγ1-Jγ12的PCR扩增产物进行凝胶电泳分离和纯化回收。

3.2用pGEM-T载体试剂盒(Promega公司产品)及其提供的方法将已纯化的PCR产物与T-载体连接。于转化前将连接物置12～16℃ 2h。

3.3感受态细胞制备及转化：按常规法制备感受态细胞、转化细菌及提取重组质粒DNA^［6］，并加入X-gal和异丙基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）进行蓝白斑菌落鉴定。

3.4阳性克隆鉴定：①以质粒DNA为模板进行PCR扩增。②质粒的酶切鉴定：每份标本分别用限制性内切酶ScaⅠ（酶切pGEM-T 载体的1890bp位点）和Eco 52Ⅰ（酶切pGEM-T 载体的31，43，77 bp位点）酶切质粒DNA，酶切产物于7g/L琼脂糖凝胶中电泳，同时以蓝斑及分子量标记物作对照。

4测序由军事医学科学院及瑞士Micro-Synth JMBH 公司提供测序结果。

结果

1形态学和免疫学分型27例ALL患者中，L₁型6例，L₂型21例。19例B-ALL按Drexler等六型分类法^［8］进行免疫分型： BⅠ型1例，BⅡ 型1例，BⅢ型7例，BⅣ型9例，BⅤ型1例。

2PCR扩增结果34份ALL患者的TCR δ、γ基因重排PCR产物呈单克隆特异性扩增，片段大小分别为250，270bp。而阴性对照者呈无条带片状或多克隆性扩增。

3T-载体阳性克隆的鉴定

3.1PCR扩增鉴定：以质粒DNA为模板进行PCR扩增，产物经20g/L的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）电泳分离20min，以分子量标记物鉴定产物， 34份标本电泳结果均显示单克隆特异性扩增。

3.2质粒的酶切鉴定：分别用限制性内切酶ScaⅠ、Eco52Ⅰ酶切质粒DNA，酶切产物于7g/L琼脂糖凝胶中电泳，与蓝斑（载体质粒DNA约3000bp）及分子量标记作比较。酶切鉴定结果表明：PCR产物与T-载体的连接是成功的(图1，2)。

图1用ScaⅠ内切酶酶切pEGM-T载体重组质粒DNA

(1890bp位点)的电泳结果

4TCRδV-D 、TCRγV-J连接区重排序列动态分析34份ALL 患者标本的PCR产物T-载体克隆测序结果显示：pGEM-T 载体60～61bp均有特异性重排片段插入，表明T-载体克隆成功及ALL患儿高度的基因重排频率（达100%）和恶性细胞克隆同源性，印证了PCR方法的特异性。

图2用Eco52Ⅰ内切酶酶切pEGM-T载体重组质粒DNA

(31，43，77bp位点)的电泳结果

4.1动态分析24份ALL初诊、CR及复发患者标本的TCRδV-D重排序列，发现呈一定规律性改变： ① 初诊组10份患者标本的Dδ3重排序列均较完整，其中7份伴Dδ3九碱基序列区T→C突变；Vδ2重排序列7份完整，3份有Vδ2的3′末端序列部分缺失；Dδ2序列部分缺失7份，完全缺失3份；均有Dδ1序列完全缺失。该组Dδ3重排序列完整率达100%；Vδ2序列缺失率为30%；