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Construction and transient expression of an Ala 737→Glu mutant of vWF
WANG Yingchun, ZHANG Jingyu, WAN Haiying, et al.
(Thrombosis and Hemostasis Research Unit, The First Affiliated Hospital, Suzhou Medical College, Jiangsu Institute of Hematology, Suzhou215006, China)
【Abstract】ObjectiveTo study the functional change of an Ala737→Glu substitution mutant of vWF and the molecular pathological mechanism of this mutant in the type 2A vWD. MethodsThe expression plasmid pSVvWF containing full-length cDNA of vWF was used to site direct mutagenesis by polymerase chain reaction(PCR) and transitorily expressed in the COS-7 cells, vWF:Ag in the supernatant and the cell lysate between wild type and pSVAla737Glu vWF were measured. vWF polymers of the platelet of the patient with the mutation and response to DDAVP treatment of the patient were observed. ResultsvWF:Ag level of pSVAla 737Glu vWF was 76.4% and 98.8% of the wild types in the supernatant and cell lysate, respectively. The polymer pattern of extracellular pSVAla737Glu vWF was indistinguishable from that of the wild type, containing all kinds of molecular weight. Increased vWF antigen levels was observed in the patients after DDAVP treatment. ConclusionThis mutant did not change the assembly and secretion of vWF. The mutant of vWF Ala737→Glu resulted in Group Ⅱ type 2A vWD.
【Key words】von Willebrand factor;Mutation;Site direct mutagenesis；Gene expression
血管性血友病因子(vWF)在初期止血过程中起重要作用，它与血管内皮下基质及胶原相结合，同时与血小板上的受体GpⅠb、GpⅡb/Ⅲa相结合，导致血小板的粘附和聚集。在vWF上有与胶原、GpⅠb、GpⅡb/Ⅲa等结合的特定结构域。vWF功能存在着精细的调控，其蛋白不同区域的氨基酸置换会导致不同类型的血管性血友病。vWF Ala737Glu是一新的基因突变［1］，为进一步了解Ala737Glu氨基酸改变对vWF功能的影响，我们构建了Ala737Glu vWF的突变体，在COS-7细胞中进行了表达，对其抗原表达量和蛋白质特性进行了研究。
材料和方法
1聚合酶链反应(PCR)产物的克隆和测序以含vWF全长cDNA的野生型表达质粒pSVvWF(Sadler JE教授惠赠)为模板。
引物：
扩增含有突变体的PCR产物。PCR反应体系为50μl，包括200μmol/L dNTPs,10mmol/L Tris-HCl,50mmol/L KCl, 1.5mmol/L MgCl2，正反向引物各20pmol,DNA模板50ng,Taq DNA聚合酶1.5U。退火温度60℃，35个循环，以20g/L的琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。
PCR产物通过补平、磷酸化、纯化后与SmaⅠ酶切的载体pUC18相连接、转化后，提取质粒用BamHⅠ，HindⅢ双酶切进行克隆鉴定，克隆的全长PCR产物用双脱氧末端终止法进行序列测定。
2利用突变基因最近的酶切位点NcoⅠ和KpnⅠ把带有突变体的片段克隆进表达载体，操作过程中为了避免重复的酶切位点，采取了一系列的中间载体的置换，最终获得含Ala737Glu突变体的全长vWF表达质粒pSVAla737Glu vWF。
3pSVvWF和pSVAla737Glu vWF的转染和表达处于对数生长期的COS-7细胞，以2×105个细胞接种在直径为35mm的组织培养皿上，用DMEM完全培养液，于37℃含CO2的培养箱中培养12～16h，使细胞达50％～80%的融合。用无血清培养基和Opti-MEM培养基洗涤待转染的细胞，Opti-MEM培养基孵育30min备用。每份转染细胞用100μl Opti-MEM培养基稀释lipofectamine(购自GIBCO/BRL公司)10μl和已纯化的质粒2μg室温孵育30min。脂质体和DNA的混合物加0.9ml的Opti-MEM培养基打匀滴加在待转染的细胞上，于37℃含CO2的培养箱中培养5h，弃转染混合物，每皿加完全培养基2ml，48h后收获上清，收获的上清中加40μl的混合蛋白酶抑制剂。培养的细胞用PBS洗涤2次，用细胞裂解液2ml(150mmol/L NaCl,50mmol/L Tris-HCl，pH 7.5, 5g/L SDS，10g/L NP40,5mmol/L EDTA, 2mmol/L 碘乙酸，2mmol/L N-乙基顺丁烯二酰亚胺和2mmol/L PMSF)进行细胞裂解。
4转染的内对照pSVβ-Gal质粒以同上方法进行转染，与完全培养基孵育48h后弃上清，PBS洗涤细胞3次，用Promega公司提供的方法进行染色，显微镜下观察转染效率。
5ELISA法检测野生型和突变体转染COS-7细胞的表达上清和细胞裂解液，参照文献［2］进行vWF∶Ag检测。
6表达上清的多聚物分析COS-7细胞的表达上清经过超滤后以ELISA法定量，每孔含vWF∶Ag 30ng进行血浆多聚物分析。
7血小板多聚物分析参照文献［3］取先证者的父亲静脉血5ml，用EDTA抗凝，800r/min离心5min，分离富含血小板的血浆（PRP），PRP与等量的溶液Ⅰ(0.013mol/L柠檬酸、0.028mol/L 葡萄糖、0.123mol/L NaCl，0.005mol/L EDTA-Na2，0.001mol/L亮抑制肽，pH 6.5)混合，2000r/min离心20min，弃上清用溶液Ⅰ洗涤2次，然后将血小板重悬在溶液Ⅱ(0.01mol/L Tris, 0.14mol/L NaCl,0.005mol/L EDTA-Na2，0.001mol/L 亮抑制肽)-70℃冻融5次。最后1次融化以10000r/min离心5min，上清以15g/L的SDS-琼脂糖凝胶进行电泳。
8DDAVP(糜凝)的治疗患者用药前检测vWF∶Ag的含量，按0.3μg/kg的用量，生理盐水稀释后静脉注射，30min推注完毕。在30min和1h再次检测vWF∶Ag的含量，比较用药前后的变化。
结果
1pSVAla737Glu vWF突变体的构建全长vWF的cDNA用EcoRⅤ和HindⅢ酶切置换到pET20b，获得中间载体pET20b vWF1。然后，利用pET20bvWF1中的单一酶切位点BamHⅠ和KpnⅠ，使获得的片段置换进pUC18，获得中间载体pUC18F2。引物P1和P2扩增含有NcoⅠ，KpnⅠ和4499位核苷酸C→A突变的256bp的PCR产物F3′，以平端克隆进pUC18，测序结果表明，PCR产物除4499位核苷酸存在C→A突变外，其余序列与野生型相同。
测序正确的PCR产物F3′通过NcoⅠ，KpnⅠ位点，替换pUC18F2中的F3′，获得pUC18F2′，再经过中间载体pET20bvWF1′，最后获得带有突变体的表达质粒pSVAla737Glu vWF。最终表达质粒酶切鉴定结果见图1。
图1pSVvWF和pSVAla737Glu vWF的酶切鉴定
2β-Gal转染效率的观察β-Gal基因与pSVvWF共转染COS-7细胞，经X-gal染色呈蓝色，计算转染效率为38.6%。
3ELISA法检测vWF∶Ag表达水平pSVvWF的表达上清vWF∶Ag的平均含量为170μg/L, pSVAla737GluvWF表达上清vWF∶Ag的平均含量为129.9μg/L，突变体的表达上清vWF∶Ag的含量是野生型的76.4%。突变体细胞裂解液中的vWF∶Ag表达量是野生型的98.8%，两者差异无显著性。
4浓缩后的表达以上清vWF∶Ag各30μg进行多聚物分析，表达上清中所形成的多聚物存在大中分子量的卫星条带，野生型和突变体的差异无显著性(见图2)。
5血小板中多聚体分析患者血小板裂解液中存在大中分子量的多聚物，与突变体在体外COS-7细胞中的表达一致(见图3)。
1：转染pSVvWF质粒的细胞表达上清；2：转染pSVAla737Glu vWF质粒的细胞表达上清；3：2A型vWD患者血浆
2表达上清的多聚物分析
图3Ala 737GluvWF患者和正常人血小板vWF多聚物分析
6DDAVP治疗前，患者vWF∶Ag含量为10.37%，按0.3μg/kg的用量，30min后检测vWF∶Ag含量为178.45%，1h后再次检测vWF∶Ag的含量为176.12%。用药后30min vWF∶Ag的含量是用药前的17.2倍。
