【摘要】目的探讨逆转录病毒介导的多药耐药基因(mdr1)导入人CD₃₄⁺细胞的影响因素，以提高基因转导效率。方法用流式细胞术(FCM)检测不同组合细胞因子及人骨髓基质细胞+细胞因子支持的基因转导效率；用造血祖细胞集落培养观察耐药性；用FCM检测不同浓度紫杉醇素对基因转导细胞的作用。结果细胞因子SCF+Flt配体(FL)+IL-3组合支持的基因转导效率高于其它组合（SCF+IL-6+IL-3,SCF+IL-6+IL-3+Tpo,SCF+IL-3）。骨髓基质细胞+细胞因子（SCF+FL+IL-3）支持的基因转导效率（20.5%）又高于单纯用该组细胞因子的转导效率（15.2%）,并且前者形成的抗性集落形成细胞数多于后者。在10?ng/ml紫杉醇作用下基因转导CD₃₄⁺细胞的阳性率可达38.5%。结论骨髓基质细胞+细胞因子(SCF+FL+IL-3)对基因转导有较强的促进作用；一定浓度的紫杉醇具有富集基因转导细胞的作用。

Exploration of factors increasing transfer efficiency of retroviral mediated multidrug resistance gene (mdr1) into human CD₃₄⁺ cells

TONG Ying*, PAN Lingya, ZHOU Sheng, et al.

(Peking Union Hospital, CAMS & PUMC, Beijing100730，China)

【Abstract】ObjectiveTo explore factors influencing transfer of retroviral mediated multidrug resistance gene (mdr1) into human CD₃₄⁺ cells. MethodsTransduction efficiency in the presence of different combinations of cytokines and human bone marrow stromal cells plus cytokines were determined by flow cytometry (FCM).Drug resistance was evaluated by plating yields of cultured hematopoietic progenitor cells. The effect of Taxol at different concentrations on mdr1 gene transfer cells was determined by FCM. Result Transduction efficiency in the presence of SCF+FL+IL-3 was higher than that in other combinations of cytokines(SCF+IL-6+IL-3,SCF+IL-6+IL-3+Tpo,SCF+IL-3). Transduction efficiency (20.5%) in the presence of bone marrow stromal cells plus cytokines(SCF+FL+IL-3) was higher than that (15.2%) without stromal cells, and the number of drug-resistant colony-forming cells was more in the former than in the latter. The percentage of CD₃₄⁺ cell with the gene transduction at 10?ng/ml Taxol reached 38.5%. ConclusionHuman bone marrow stromal cells plus cytokines (SCF+FL+IL-3) is more effective in enhancing mdr1 gene transduction. Taxol at a certain concentration can enrich mdr1 gene transferred cells.

【Key words】Resistance, multidrug;Hematopoietic stem cell;Gene transfer;Bone marrow stromal cells;Hematopoietic cell growth factors

多药耐药基因（mdr1）编码相对分子质量为170×10³的跨膜糖蛋白（P170），该蛋白作为依赖ATP能量的溢出泵，可将进入细胞内的多种药物如紫杉醇(商品名Taxol)、阿霉素等排出细胞外^［1］。正常骨髓造血细胞P170表达量极低，将外源性mdr1基因导入其中，肿瘤化疗时可起到保护造血细胞的目的。提高基因转导效率是转基因治疗成功的关键。我们对影响逆转录病毒载体介导的mdr1基因导入人CD₃₄⁺细胞的一些因素进行探讨，试图找出较适宜的转导条件，以提高转导效率，为造血细胞基因治疗打下基础。

材料和方法

1包装细胞的建立及病毒上清的制备用脂质体介导转染法，将含人全长mdr1 cDNA的重组逆转录病毒载体SF-mdr1（由德国Baum博士赠送）导入双嗜性包装细胞GP-envAM12，用60?ng/ml秋水仙素筛选获得抗性克隆。收集其培养上清，感染同样方法获得的单嗜性包装细胞GP-E86，收集GP-E86抗性克隆培养上清，再次感染GP-envAM12抗性克隆。用NIH3T3细胞测其病毒上清滴度为1.6×10⁵ cfu/ml。将包装细胞培养到满瓶的80%，更换培养液，置32?℃培养24?h，收集病毒上清，用0.45?μm滤膜过滤后立即使用。

2CD₃₄⁺细胞的分离纯化取正常足月妊娠脐血，用淋巴细胞分离液密度梯度离心分出单个核细胞，再按单克隆抗体(单抗)-免疫磁性分离系统说明书分离出CD₃₄⁺细胞。磁性细胞分离仪和CD₃₄⁺细胞分离试剂盒由Miltenyi Biotec公司提供。流式细胞仪测CD₃₄⁺细胞纯度为80％～87％，抗体为标记了藻红蛋白(PE)的抗CD₃₄单抗（Immunotech公司）。

3骨髓基质细胞的制备骨髓细胞取自胸外科手术切除的肋骨。用注射器冲出肋骨中的骨髓，稀释后用淋巴细胞分离液密度梯度离心分出单个核细胞。按9×10⁶/ml细胞接种于培养瓶中，用长期培养液Myelocult H5100(Stem cell 公司) 和1×10^-6mol/L的氢化考的松，在33?℃孵箱中培养4周，每周半量换液。经16?Gy ⁶⁰Co 射线照射，然后用2.5?g/L胰酶消化后收集细胞，以2.5×10⁵细胞接种于24孔培养板中，待其贴壁后即可使用。

4重组造血细胞因子除SCF为Amgen公司产品，其余均由Peprotech公司提供。SCF 50?ng/ml、FL 50?ng/ml、IL-3 10?ng/ml、Tpo10?ng/ml、IL-610?ng/ml。细胞因子分组为：①SCF+IL-3+IL-6；②SCF+IL-3+FL；③SCF+IL-3+IL-6+Tpo；④SCF+IL-3。

5CD₃₄⁺细胞体外转染

5.1细胞因子支持的转染：将CD₃₄⁺细胞按5×10⁴/ml接种于24孔板，每孔1?ml培养体系。IMDM培养液（Gibco公司）中含有体积分数为15％的马血清、1×10^-4mol/L 2-巯基乙醇、2?mmol/L L-谷氨酰胺、100?g/L牛血清白蛋白及不同分组的重组细胞因子，37?℃培养48?h。吸去0.5?ml培养液，加入1?ml新鲜收集的病毒上清、上述剂量的相应细胞因子及8?μg/ml 鱼精蛋白（Sigma公司）。每24?h重复转染1次，连续3次后，离心去除培养上清，再加入原培养体系，培养48?h，收集细胞进行不同目的的培养及检测。

5.2细胞因子＋骨髓基质细胞支持的转染:将CD₃₄⁺细胞按5×10⁴/ml接种于铺有骨髓基质细胞的24孔板中，加入SCF，FL，IL-3等细胞因子，其余转染过程同上。

6造血祖细胞耐药性检测收集未转基因组、细胞因子（SCF＋FL＋IL-3）支持的转基因组及细胞因子＋基质细胞支持的转基因组CD₃₄⁺细胞，用甲基纤维素半固体集落培养法培养集落形成细胞（CFC），加入不同浓度的Taxol，每个样品种植3个孔，培养14天后计数CFC数。

7Taxol作用下的转基因CD₃₄⁺细胞的培养收集细胞因子（SCF＋FL＋IL-3）支持的转基因组CD₃₄⁺细胞接种于24孔板，在原液体培养体系中加入一定范围浓度的Taxol，37?℃孵箱培养1周，收集细胞进行检测。

8转基因CD₃₄⁺细胞mdr1基因表达产物P170及其功能的测定用PE标记的抗P170单抗UIC-2（Immunotech 公司）标记细胞，然后用流式细胞术（FCM）检测P170阳性率。用罗丹明（Rh-123）排出试验^［2］测定P170的功能。

结果

1不同造血细胞因子组合作用下的转导效率以各组相应的未转基因组细胞为对照，将细胞因子组合：①SCF＋IL-3＋IL-6；②SCF＋IL-3＋FL；③SCF＋IL-3＋IL-6＋Tpo；④SCF＋IL-3。在四组因子作用下转染的CD₃₄⁺细胞，用FCM检测其mdr1基因表达产物P170，得出转导效率分别为12.1％、19.3%、12.3%、9.8%。其中以SCF＋FL＋IL-3组基因转导效率最高(与其它各组比较，P＜0.01)。Rh-123排出试验也显示该组排出Rh-123的功能较强，其中有P170功能的细胞占15.2%。

2骨髓基质细胞+细胞因子与单纯细胞因子作用下的转导效率及其转基因造血祖细胞对化疗耐受性的比较对细胞因子（SCF＋FL＋IL-3）及同组细胞因子＋骨髓基质细胞作用下的转基因CD₃₄⁺细胞行Rh-123排出试验。根据有P170功能的细胞数得出其转导效率分别为15.2%、20.5%，差异有显著性（P＜0.05）。在一定浓度范围的Taxol作用下，以未转基因组细胞为对照，细胞因子支持的转基因组及细胞因子＋骨髓基质细胞支持的转基因组CD₃₄⁺细胞形成的CFC结果见表1。当Taxol浓度为10?ng/ml时，细胞因子＋基质细胞支持的转基因组形成的CFC数高于单纯细胞因子支持的转基因组，差异有显著性（P＜0.05）。

3Taxol对转基因CD₃₄⁺细胞的作用以未转基因CD₃₄⁺细胞为对照，转基因CD₃₄⁺细胞在含细胞因子SCF＋FL＋IL-3的液体培养体系中培养1周。用Rh-123排出试验检测P170功能，结果显示：当Taxol浓度为0，5，10?ng/ml时，其具有P170功能的细胞分别为15％、22.7％、38.5％，三者间差异有显著性（P＜0.05）。但当Taxol浓度继续升至15?ng/ml以上时，转基因及未转基因组CD₃₄