关键词： 细胞株，HFCL；基因；配体；血小板源生长因子；基因表达

【摘要】目的探讨应用内部核糖体进入位点（IRES）序列对逆转录病毒介导的人Flt 3配基(FL)与血小板生成素(Tpo)基因在骨髓基质细胞系HFCL中的表达。方法利用基因重组技术将IRES序列与FL和Tpo基因构建到逆转录病毒载体中，脂质体法将重组质粒pLFTSN和空载体pLXSN转染PA317细胞，经G418筛选。用抗性克隆培养上清感染HFCL细胞，RT-PCR和基因组DNA PCR分析mRNA的表达及基因组整合情况，CFU-GM集落法和Tpo依赖株法测定生物学活性。结果成功构建出含IRES序列的FL与Tpo基因逆转录病毒载体，mRNA水平及基因组中整合有FL与Tpo基因，生物学活性测定表明转染的骨髓基质细胞同时分泌FL与Tpo。结论IRES序列调控FL与Tpo双基因在骨髓基质细胞中同时独立表达，为进一步研究转基因骨髓基质细胞对造血调控的影响奠定了基础。

Expression of human flt3 ligand and thrombopoietin genes in a bone marrow stromal cell line by internal ribosome entry site （IRES）sequence

ZHANG Yi, TANG Peixuan, LI Xiusen, et al.

*Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing100850

【Abstract】ObjectiveTo explore the feasibility of retroviral-mediated Flt 3 ligand (FL) and thrombopoietin (Tpo) genes transferred into and expressed in a bone marrow stromal cell line HFCL by internal ribosome entry site（IRES）sequence.MethodsIRES sequence, FL and Tpo cDNA were recombined with retroviral vector pLXSN by gene recombination technology. The recombinant plasmid was transferred into retrovirus packaging cell line PA317 by lipofectamine, and the resistant clones were selected by G418 selective medium. mRNA expression in HFCL cells and integration of genome DNA were assayed by RT-PCR and genomic DNA PCR. The biological activities of FL and Tpo in the culture were investigated by CFU-GM assay and Tpo dependent cell line TD-3,respectively.ResultsThe recombinant plasmid pLFTSN was successfully constructed. In the genome of these transfected target cells, Neo gene and FL and Tpo cDNA were intergrated, the expression of FL and Tpo mRNA was detected in HFCL cells. The specific activities of FL and Tpo in the culture indicated that HFCL cells transfected with FL and Tpo cDNA could significantly express FL and Tpo in vitro.Conclusion FL gene and Tpo gene were simultaneously expressed in bone marrow stromal cell line by the regulation of IRES sequence. These results provide a basis for studies on hematopoietic regulation by gene transfected bone marrow stromal cells.

【Key words】Cell line，HFCLGeneLigandsPlatelet-derived growth factorGene expression

造血微环境由骨髓基质细胞，细胞外基质及各种造血生长因子组成。骨髓基质细胞作为造血微环境中的主要成分，对造血细胞的增殖与分化具有重要的调控作用。血小板生成素（Thrombopoietin, Tpo）和造血干细胞刺激因子Flt3配基（Flt3 ligand, FL）是最近发现的对早期造血具有重要调控作用的造血生长因子^［1］。我们采用基因重组技术，通过引入对表达基因具有重要调控作用的内部核糖体结合位点（Internal Ribosome Entry Sites，IRES）序列，构建含FL与Tpo双基因逆转录病毒载体，转染人骨髓基质细胞系HFCL，最终在此细胞中获得具有各自生物学活性，且同时独立表达的FL与Tpo，为进一步研究转基因骨髓基质细胞对造血的调控奠定了基础。

材料和方法

1质粒和细胞系含人FL基因膜外区546 bp质粒和全长人Tpo基因1.1 kb质粒均由本室构建，含长度为585 bp IRES序列的真核表达载体pIRZA1 neo购自美国Invitrogen公司。PA317细胞和NIH 3T3细胞由本室保存，人骨髓基质细胞系HFCL由中国医学科学院血液学研究所宋增璇教授惠赠。HFCL细胞是由人骨髓细胞分离出的一株成纤维样细胞系，细胞呈梭形。

2主要试剂限制性内切酶和连接酶等为Promega和Gibco公司产品，总RNA提取试剂盒为Gibco公司产品，RT-PCR试剂盒购自日本Tokara公司，DNA纯化试剂盒及基因组DNA提取试剂盒购自Promega公司， DMEM、IMDM和RPMI1640培养基购自Gibco公司，小牛血清、胎牛血清和马血清购自北京军区兽医研究所，重组人FL与Tpo标准品购自英国Preptech公司。

3人FL与Tpo双基因逆转录病毒载体构建质粒的提取、酶切、连接、转化、鉴定和反应等参照文献［2］进行。

4包装细胞转染及病毒滴度测定采用脂质体介导的基因转移方法将含人全长FL-IRES-Tpo的重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞，用含800 μg/ml G418的选择培养基筛选，获得抗性克隆后，收集上清进行病毒滴度测定。

将对数生长期NIH3T3细胞接种于6孔板中（1×10⁵/孔），每孔加不同浓度的病毒上清及终浓度为8 μg/ml Polybrene培养12小时，按1∶10传代培养48小时，筛选2周，克隆形成后甲醇固定，Giemsa染色，计数克隆，计算病毒滴度。

5人骨髓基质细胞系培养及转染将5×10⁵HFCL细胞接种于6孔板，按1.4所述方法筛选阳性克隆（HFCL/pLFTSN和HFCL/pLXSN），扩大培养，接种于不含G418的培养基中培养24～48小时，收集上清液，过滤后，-20 ℃贮存备用。

6外源基因在细胞基因组中的整合及表达转染细胞中RNA的提取按试剂盒说明进行，采用RT-PCR法检测FL与Tpo基因mRNA的表达。基因组DNA提取按试剂盒说明进行，PCR法检测基因组DNA及Neo基因。PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。收集转染细胞24小时培养上清，经超滤浓缩后， Western Blotting 检测蛋白水平的表达。

FL基因引物序列：上游引物：5′-CGGGTACCATGACAGTGCTGGCGCCAGCCT-3′；下游引物：5′-CCGGATCCTCACGGGGCTGTCGGGGCT-3′。

Tpo基因引物序列：上游引物：5′-CCGGAATTCATGAGCCCGGCTCCTCCTGCTT-3′；下游引物：5′-CGTCTAGATGATGTCGGCAGTGTCTGAGAACC-3′。

Neo基因引物序列：上游引物：5′-ACAATCGGCTGCTCTGAT-3′；下游引物：5′-CTCGCTCGATGC-GATGTT-3′。

7转染细胞上清FL和Tpo的生物学活性测定以小鼠骨髓细胞，按CFU-GM集落培养法^［3］进行。取小鼠经颈椎脱臼处死后，分离股骨，冲出骨髓细胞，甲基纤维素半固体培养基中加入不同浓度的上清液及血清等成分，分别在35 mm皿中培养7天，显微镜下计数集落数。

选用Tpo依赖的细胞株TD-3，以MTT法测定Tpo活性^［4］。传代培养的TD-3细胞用生理盐水洗3次后，调整细胞浓度为1×10⁴/ml，取50 μl细胞悬液加到96孔培养板中，再加入按一定比例稀释的样品，以Tpo标准品为阳性对照，培养板置37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱中培养后，每孔加20 μl MTT，继续培养4小时，加入100 μl裂解液溶解生成的沉淀，酶联仪上测定吸光度(A)₅₄₀值。

结果

1含IRES序列的FL/Tpo双基因表达质粒的构建为了使FL与Tpo基因在同一载体中分别同时表达，我们先将长度为546 bp的FL基因导入含IRES序列真核表达载体pIRZA1neo中，获得含IRES的质粒pIRFL，而后将pIRFL及长度为1.1 kb的Tpo基因同时构建到pUC18载体中，构成含FL、IRES和Tpo的质粒pUCFT，最后将FL、IRES和Tpo导入逆转录病毒载体构成pLFTSN质粒。具体构建图见图1。

1含IRES序列的重组逆转录病毒载体pLFTSN构建图

2逆转录病毒滴度的测定及基质细胞基因转移将pLFTSN和pLXSN用脂质体法转染PA317细胞，经G418筛选并用其上清液感染NIH3T3细胞，计算病毒滴度PA317/pLFTSN为5.0×10⁵cfu/ml，PA317/pLXSN为6.5×10⁵cfu/ml，同样，用两组上清液感染HFCL细胞也获得大量抗性克隆。结果表明重组载体转染PA317细胞后，包装出具有感染靶细胞能力的病毒，并可介导其基因转移。

3鉴定外源基因在HFCL细胞中mRNA水平和蛋白水平的表达以及染色体基因组的整合情况提取培养细胞总RNA，用RT-PCR方法对基因转导细胞进行mRNA水平分析，结果表明转染细胞中有FL与Tpo的mRNA水平表达。提取转染细胞基因组DNA，用PCR技术进行Neo基因、FL和Tpo cDNA的特异性分析，结果显示转染细胞基因组中分别整合有逆转录病毒载体中的Neo基因、FL和Tpo基因（图2、图3）。Wester