人端粒重复序列结合因子(TRF1)是一种端粒重复序列结合蛋白, 含439个氨基酸，相对分子质量约为60×10³，该蛋白的氨基端为酸性区, 是与DNA结合的功能区，称Myb区。蛋白质的中间约包含200个氨基酸，比较保守, 称TRF特异保守区。我们克隆并表达了TRF1的第242-388个氨基酸，旨在制备TRF1特异性抗体，以进一步应用于TRF1作用机制和TRF1与血液系统恶性肿瘤的相互关系研究。

材料和方法

1质粒与菌株pCRⅡ-TOPO-TRF1重组质粒为本研究所黄河博士在德国基尔大学血液病理研究所构建。pGEM-T easy系统购自Promega公司, 为PCR产物克隆载体。pET30a(+)质粒全长5 422 bp, 为T₇ RNA聚合酶/启动子表达系统, 所表达的融合蛋白带有6个连续的组氨酸残基, 购自Novagen公司。DH5α、BL 21(DE3)购自Novagen公司。 KpnⅠ、BamHⅠ、T₄ DNA连接酶、Taq酶、dNTP、LB细菌培养基、聚丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED等购自上海生工公司。DNA胶上回收及纯化试剂盒购自上海华舜试剂公司。 Ni-NTA HRP购自Qiagen公司。用于鉴定带有连续6个组氨酸残基的表达蛋白。

2方法

2.1PCR扩增TRF1 cDNA：根据人TRF1 cDNA全序列^［1］, 经计算机分析，选取与人TRF2 cDNA和鼠TRF1 cDNA的同源性最低的片段，PCR扩增TRF1 cDNA。使引物的酶切位点与pET30a(+)中的位点匹配，保证阅读框架正确。扩增条件为：94 ℃1分钟，55 ℃45秒，72 ℃50秒。引物序列为：

上游引物: 5′-TCAGGTACCTTTCTAATGAAGGCAGCG-3′；

KpnⅠ

下游引物: 5′-CCAGGATCCCTCTCCATATTTCCTCAC-3′

BamHⅠ

2.2PCR产物胶上回收及纯化：扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，切取含靶序列的凝胶，按试剂盒说明操作。

2.3pGEM-TRF1^242-388的建立：连接PCR回收产物和pGEM-T, 转化DH5α, 筛选重组子。DNA的连接反应、酶切反应、碱裂解法质粒抽提、感受态细菌的制备、转化等参考《分子克隆实验指南》^［3］。

2.4重组表达质粒的构建及鉴定：以KpnⅠ和BamHⅠ酶切pET30a和pGEM-TRF1，电泳后胶上回收pET30a 和TRF1 cDNA片段，连接后转化DH5α,筛选重组子pET30a-TRF1^242-388，以酶切图谱和DNA序列测定鉴定插入片段。

2.5测序：PE公司377型全自动荧光测序仪，引物为T₇启动子引物:5′-TAATACGACTCACTAT-3′。

2.6蛋白表达菌株及最佳诱导时间的筛选：以pET30a-TRF1^242-388转化大肠杆菌BL 21(DE3)，挑取单克隆细菌，接种于2 ml LB细菌培养基，37 ℃280 r/min振荡培养至A₆₀₀=0.6, 然后100 μl接种于5 ml LB培养基，以同样条件培养至A₆₀₀=0.6，取出1 ml为对照，加入IPTG终浓度为1 mmol/L诱导蛋白表达，分别于1，2，3，4小时各取1 ml菌液，离心收集细菌，加100 μl PBS 超声粉碎，经Follin-酚法蛋白定量，每泳道40 μg上样，150 g/L SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝染色，脱色后干胶。

2.7TRF1^242-388蛋白质的大量诱导表达及含量测定：在250 ml的锥形瓶中加入100 ml LB培养基，IPTG诱导2.5小时后收集细菌，重悬于含10 ml 10 g/L TritonX-100的PBS中，冰上超声处理10秒，停20秒，反复5次。每泳道40 μg总蛋白电泳，考马斯亮蓝染色，脱色后干胶，激光扫描，计算诱导蛋白占细菌总蛋白的百分比。

2.8免疫印迹（Western blot）鉴定诱导蛋白：以转化pET30a质粒的细菌蛋白为对照，每个泳道加2 μg菌体总蛋白，经150 g/L的SDS-PAGE电泳，转膜，含3 g/L BSA的TBS缓冲液封闭, TBS-吐温1/1 000稀释的Ni-NTA HRP 室温反应1小时, TBS-吐温洗膜3小时。加强化学发光法显示特异条带，X光胶片感光，显影，定影。

结果

1TRF1 cDNA的扩增扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，可见DNA条带在377 bp附近(理论长度为393 bp)，见图1。

1：λDNA HindⅢ/EcoRI标记；2：PCR 产物；

3：KpnⅠ、BamHⅠ酶切的质粒pET30a-TRF1^242-388； 4：PCR标记

图1PCR产物和pET30a-TRF1^242-388的KpnⅠ、BamHⅠ酶切

产物的琼脂糖电泳图

2重组表达质粒的鉴定酶切图谱结果见图1，序列测定结果显示与原始的TRF1 cDNA相应序列一致。

3诱导蛋白的SDS-PAGE电泳IPTG诱导1～4小时细菌蛋白电泳结果表明在相对分子质量约20×10³处比含pET30a的阴性对照多出一条蛋白带，和预计的融合蛋白大小基本一致。诱导1小时即可见蛋白表达，2小时时增加，3，4小时的蛋白量与2小时相比增加不明显。故选定2.5小时为最佳诱导时间。大量诱导蛋白的电泳染色结果见图2。

a:1蛋白相对分子质量标记；2转染了pET30a的BL21(DE3)； 3BL21(DE3)-TRF1^242-388蛋白；→处为融合表达蛋白

b:1，3转染了pET30a的BL21(DE3)蛋白；2，4：BL21(DE3)-TRF1^242-388蛋白(诱导后)

2a:BL21(DE3)-TRF1^242-388蛋白的SDS-PAGE；b:BL21(DE3)-TRF1^242-388蛋白的免疫印迹

4免疫印迹在相对分子质量20×10³处可见特异性亮带，而阴性对照则未见亮带出现(图2b)。

5诱导蛋白含量测定诱导蛋白占细菌总蛋白的17.4%。

讨论

端粒重复序列结合因子（TRF1）是端粒复合体的一种蛋白，具有抑制端粒酶活性的作用。1997年Shen 等^［4］发现另一个比hTRF1缺少20个氨基酸（第283-302个氨基酸：SVSDKQSAVTESSEGTVSLL）的PIN2，PIN2也结合在TTAGGG重复序列上并且和hTRF1具有相同的功能，所以认为它们来自同一基因, 是RNA不同剪接的结果。在基因库中同称hTRF1。在Hela、 LF、HFF细胞中, PIN2 mRNA是hTRF1 mRNA的5～10倍, 我们克隆的TRF1^242-388中间缺失20个氨基酸, 这可能是由于这种形式的mRNA在组织中更为丰富，易于扩增。不管是实体瘤还是血液系统肿瘤细胞，其端粒酶活性往往比正常组织高，而且增高的程度与疾病预后有关^［5，6］。端粒重复序列结合因子(TRF)作为端粒酶活性的调节因子，已成为肿瘤发病机制的研究热点，目前尚无TRF1单克隆抗体、hTRF1与人类各系统恶性肿瘤关系的报道。我们经过计算机对人TRF1、TRF2和鼠TRF1cDNA序列同源分析，选取变异性最大的片段作为PCR扩增对象，获得特异蛋白用来制备人TRF1特异性抗体，从而用于TRF1作用机制研究。

本课题受国家自然科学基金(39870339)资助

本工作在浙江医科大学分子生物学中心实验室完成

参考文献

1Chong L, Steensel BV，Broccoli D， et al. A human telomeric protein. Science， 1995, 270:1663-1666.

2Steensel BV， Lange TD. Control of telomere length by the human telomeric protein TRF1. Nature， 1997, 38: 740-743.

3J 萨母布鲁克, EF 弗里奇, T 曼尼阿蒂斯著. 金冬雁, 黎孟枫，等译. 分子克隆实验指南. 第2版. 北京: 科学出版社, 1992.

4Shen M, Haggblom C, Vogt M， et al. Characterization and cell cycle regulation of the related human telomeric proteins Pin2 and TRF1 suggest a role in mitosis. Proc Natl Acad Sci U S A， 1997，94：13618-13623.

5Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR， et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, 266 :2011-2014.

6Ohyashiki JH, Ohyashiki S,Lwama S，et al. Clinical implication of telomerase activity levels in acute leukemia. Clin Cancer Res,1997, 3:619-722.

收稿：1999-04-12修回：1999-08-25