关键词： 胎血；造血干细胞；小鼠，SCID；造血干细胞移植

【摘要】目的探讨Flt-3配基（FL）、Tpo、SCF等细胞因子组合对人脐血干/祖细胞的扩增及自我更新能力的维持作用。方法用FL＋Tpo＋SCF＋IL-6＋IL-3＋G-CSF组合,体外扩增脐血CD₃₄^＋细胞14天，将其移植给亚致死剂量照射的SCID小鼠。结果扩增的脐血造血细胞可顺利植入SCID小鼠并重建造血，18只小鼠移植后存活6周的有8只，其骨髓中仍可检测到人的造血细胞，死亡率56%，与对照组(死亡率100%)比较，χ²＝10.08，P＜0.01。结论FL＋Tpo＋SCF＋IL-6＋IL-3＋G-CSF组合在有效扩增造血细胞的同时可保留造血干/祖细胞的自我更新及造血重建能力。

Studies on hematopoietic reconstitution by ex vivo expanded human cord blood hematopoietic stem/progenitor cells in SCID mice

LIU Ying, PEI Xuetao, LU Shangen, et al.

General Hospital of PLA , Beijing100853； Institute of Radiation Medicine, Beijing100850

【Abstract】ObjectiveTo elucidate the effect of the combination of cytokines on ex vivo expansion and self-renewal potential of human umbilical cord blood hematopoietic stem/progenitor cells.MethodsCD₃₄⁺ cells from cord blood were expanded for 14 days in the culture containing FL+Tpo+SCF+IL-6+IL-3+G-CSF and the expanded cells were transplanted into sublethally irradiated SCID mice.ResultsThe expanded cells were engrafted smoothly in the SCID recipients and reconstituted their hematopoiesis. Furthermore, human hematopoietic cells could be detected in the marrow of the recipients 6 weeks after transplantation.ConclusionIt is possible to expand hematopoietic cells ex vivo efficiently and maintain concomitantly their self-renewal and hematopoietic reconstitution capacities by the combination of FL+Tpo+SCF+IL-6+IL-3+G-CSF.

【Key words】Fetal bloodHematopoietic stem cellsMice,SCIDHematopoietic cells transplantation

脐血体外扩增是脐血移植亟待解决的关键问题。脐血体外扩增的目的是使造血祖细胞（HPC），尤其是CFU-GM、CFU-MK扩增的同时维持造血干/祖细胞自我更新能力，这是造血祖细胞扩增的前提，也是常用细胞因子组合(SCF＋IL-6＋IL-3＋G-CSF等)难以逾越的障碍。FL、Tpo因其作用于造血干细胞和早期祖细胞，故FL＋Tpo＋SCF＋IL-6＋IL-3＋G-CSF是目前同时扩增粒系、巨核细胞系祖细胞的最佳组合之一^［1］。我们通过将扩增的人脐血干/祖细胞移植给SCID小鼠,探讨上述组合在扩增造血细胞的同时对脐血造血干/祖细胞自我更新和造血重建能力的维持作用。

材料和方法

1脐血来自解放军总医院妇产科，肝素抗凝，平均采集量为50～70 ml，采集后24小时内的细胞悬液经PBS缓冲液稀释，Ficoll（相对密度1.077）梯度离心。收集界面层单个核细胞（MNC），洗涤备用。

2脐血CD₃₄^＋细胞体外液体扩增体系用Mini MACS免疫磁性系统分离CD₃₄^＋细胞进行扩增。IMDM培养基中含体积分数为12.5% 羟乙基淀粉(HS)、体积分数为12.5% 胎牛血清(FCS)、5×10^-7mol/L氢化可的松、2×10⁴/ml CD₃₄⁺细胞及重组人造血细胞生长因子(rhHGFs)。FL为Immunex产品，终浓度40 ng/ml；Tpo和G-CSF均为Amgen产品，浓度分别为10 ng/ml和20 ng/ml；SCF、IL-6、IL-3均为Sandoz产品，终浓度分别为50，20和2 ng/ml；上述体系接种于12孔板中，每孔1 ml，37 ℃、体积分数为5%的CO₂及饱和湿度条件下培养14天。每周半量换液。rhHGFs每48小时加入体系1次，连续加5次。14天时取出细胞用于细胞总数,CD₃₄⁺、CD_41a⁺细胞及CFU-GM检测。

3造血祖细胞集落(CFC)培养CFC试剂盒（军事医学科学院放射医学研究所）含300 g/L HS、100 g/L BSA（Sigma公司）、50 ng/ml SCF、2 ng/ml IL-3、40 ng/ml GM-CSF、5×10³U/ml G-CSF、2 U/ml Epo、5×10³CD₃₄^＋细胞/ml或5×10⁴扩增细胞/ml、IMDM及13.5 g/L甲基纤维素。上述体系接种于24孔板中，0.5 ml/孔，37 ℃、体积分数为5％的CO₂及饱和湿度的培养箱中培养14天，计数CFU-GM。

4流式细胞仪（FACS400 BDIS，USA）分析细胞表面标志标记鼠抗人CD₃₄单抗 FITC-HPCA-2（Becton Dickinson，USA）、鼠抗人CD_41a单抗+羊抗鼠IgG-FITC（北京邦定生物医学公司）分别用于检测CD₃₄⁺、CD_41a⁺细胞，1∶10（5 μl/5×10⁵细胞）稀释，4 ℃孵育20分钟，洗涤送检。

5SCID小鼠及干细胞移植SCID小鼠购于军事医学科学院动物中心，6周龄，雌雄不限；饲养于SPF环境；饮水酸化，照射前2周至照射后4周饮水中加新霉素（1 g/L）及多粘菌素B（10⁶ U/L）。给予8周龄SCID小鼠250 cGy ⁶⁰ Co γ射线照射，剂量率114 cGy/min；照射后2～4小时内从尾静脉注入250 μl单个核细胞(MNC)悬液（含IMDM、体积分数为10%FCS、3×10⁶细胞）。实验分组：①实验组：小鼠输注脐血扩增细胞；②阳性对照组：小鼠输注等量脐血MNC，并分为照射与非照射组；③阴性对照组：输注含FCS的等量无细胞培养液，也分为照射与非照射组。每组6只SCID小鼠，重复3次。对移植后死亡小鼠的骨髓、肝、肺作病理切片检查。

6脐血扩增细胞植入SCID小鼠骨髓的检测收集移植后存活6周的SCID小鼠两条股骨的骨髓细胞。

6.1流式细胞仪（Elite Coulter France）测人CD₄₅^＋细胞含量：标记抗体FITC-KC56（CoulterImmunology France）与正常SCID小鼠骨髓细胞的交叉反应性＜0.2% ；7 g/L Tris-NH₄Cl裂解骨髓红细胞，抗体按5 μg/1×10⁶细胞稀释，4 ℃孵育20分钟，洗涤送检。

6.2PCR方法测人Cart-1基因：人Cart-1基因cDNA从Hela细胞系cDNA文库提取，位于12q21.3～q22。用人外周血白细胞基因组DNA作阳性对照，正常SCID小鼠骨髓细胞基因组DNA作阴性对照，β-actin作内参照。扩增Cart-1和β-actin的反应体系和条件相同。反应体系（50 μl）：10×缓冲液 （上海Sangon公司）、5 mmol/L Mg²⁺、0.2 mmol/L dNTP（Promega公司）、0.25 μmol/L 引物（由上海Sangon合成）、1 U TaqplusⅡ（上海Sangon公司）、1 μl DNA；反应条件：94 ℃预热5 分钟后加TaqplusⅡ 进行扩增；循环参数：94 ℃ 30秒变性；64 ℃ 75秒退火；72 ℃ 45秒延伸；共30个周期；72 ℃延伸7分钟。Cart-1基因引物如下^［2］：

P₁（正义）：5′-AAGGATACCACAATAAGCTGC-3′；

P₂（反义）： 5′-GGTTTGTGGAGACTGGCAC-3′。

引物扩增片段为156 bp，仅位于人Cart-1基因3′-末端翻译序列（untranslated sequence），与鼠无同源性。

β-actin基因引物如下^［2］：

P₃（正义）：5′-AAGGCCAACCGCGAGAAGAT-3′；

P₄（反义）：5′-TCGGTGAGGATCTTCATGAG-3′。

扩增片段为249 bp。扩增片段分析以100 bp DNA Ladder（Promega公司）为标准。

结果

1FL＋Tpo＋SCF＋IL-6＋IL-3＋G-CSF组合对脐血CD₃₄⁺细胞的扩增效率脐血CD₃₄⁺细胞经FL＋Tpo＋SCF＋IL-6＋IL-3＋G-CSF组合扩增14天，可扩增有核细胞（2 129.67±57.32）倍、CD₃₄⁺细胞（82.43±4.64）倍、CFU-GM (69.88±7.12)倍、CD_41a⁺细胞(63.24±5.19)倍。

2脐血扩增细胞重建亚致死剂量照射SCID小鼠的造血实验组18只SCID小鼠存活超过6周的8只（三批分别为2，3，3只），平均死亡率56%；阳性和阴性两个照射对照组SCID小鼠死亡率均为100%，实验组与照射对照组死亡率经卡方检验，χ²＝10.08，P＜0.01。死亡时间均为移植后2～3周。死亡小鼠骨髓切片均显示骨髓空虚，肝、肺均有出血或瘀血灶。阳性对照与阴性对照未照射组的SCID小鼠全部活存，前者活存6周时未检出人造血细胞植入证据，而后者则未见输注含血清培养液相关的毒性。

3SCID小鼠骨髓中人的造血细胞植入证据我们用流式细胞仪检测移植后存活6周的SCID小鼠骨髓细胞中人CD₄₅⁺细胞含量，范围为1.28%～4.90%；用PCR方法检测小鼠骨髓细胞中人Cart-1基因的表达，结果（图1）显示：阴性对照Cart-1基因扩增产物均大于3