关键词： 基因，p15；甲基化；聚合酶链反应；白血病，急性

【摘要】目的探讨p15基因CpG岛甲基化作为各型急性白血病通用的基因标志物的可行性。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)法检测40例初治或复发急性白血病、5例完全缓解期白血病及8例(份)正常骨髓的p15基因CpG岛甲基化，并对MSP产物进行序列测定。结果急性白血病患者p15基因CpG岛甲基化阳性率为80%，AML与ALL的阳性率(分别为83%和73%)差异无显著性；5例完全缓解期白血病患者中1例p15 CpG岛甲基化阳性(该例患者不久白血病复发)；正常骨髓8例均为阴性，表明p15 CpG岛甲基化为白血病细胞所特有；MSP产物测序结果与理论结果相符合，MSP敏感度可达10^-3。结论p15 CpG岛甲基化在各型急性白血病中均有很高的发生率，可以作为各型急性白血病通用的微量残留病(MRD)指标；白血病完全缓解期p15 CpG岛甲基化仍为阳性可能预示着复发；MSP法DNA需要量极少，不需要有特异性酶切位点，无同位素污染，对标本要求不高，敏感度高，是甲基化研究的一个简便、敏感、特异的新手段。

Study on the methylation of p15 gene CpG islands in acute leukemia: using methylation-specific PCR method

ZHANG Yusheng, LOU Fangding, YU Li.

Department of Hematology, General Hospital of PLA, Beijing100853

【Abstract】ObjectiveTo explore the feasibility of the methylation of p15 gene CpG islands as a common gene marker for all types of acute leukemias(AL).MethodsThe methylation of p15 gene CpG islands in bone marrow from 40 cases of newly diagnosed or relapsed AL, 5 cases of AL in CR and 8 of normal subjects was analyzed by using methylation-specific PCR methods(MSP), and the product of MSP was sequenced.Resultsp15 gene CpG islands were methylated in 80% (32/40) of the newly diagnosed or relapsed AL， no difference between AML and ALL was observed. One positive result was found in the 5 AL patients in CR and this patient soon relapsed. The bone marrow cells from 8 normal subjects did not have p15 gene CpG islands methylation, which suggested that such methylation was peculiar to AL cells. DNA sequencing confirmed the right expected sequence. The sensitivity of MSP was 10^-3.ConclusionThe methylation of p15 gene CpG islands occurs very commonly in every types of AL. It can be used as a gene marker for ALs and for minimal residual disease in CR. MSP needs neither special methylation-sensitive restricted sites, nor high volume of DNA. There is no radioactive pollution, and the sample need not be fresh. MSP is a very sensitive, simple and specific method for the detection of DNA methylation.

【Key words】Gene,p15MethylationPolymerase chainreactionLeukemia, acute

p15基因于1994年由Kamb发现，位于染色体9p21，其产物蛋白能抑制CDK(cyclin-dependent kinase)的活性，从而阻止细胞进入增殖周期，此功能与转化因子β(TGF-β)有直接联系^［1］。许多实验显示p15在白血病中表达失活，进一步研究发现其原因在于基因发生了CpG岛的异常甲基化，而并非基因的突变或缺失。我们采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR,MSP)法，对不同类型的急性白血病p15异常甲基化进行了研究。

病例和方法

1研究对象初治或复发急性白血病共40例，均来自解放军总医院，男29例，女11例，年龄10～73岁，均符合FAB诊断和分型标准；其中急性髓系白血病(AML) 24例，急性淋巴细胞白血病(ALL)15例，粒淋混合型1例。完全缓解期白血病5例，其中AML 2例，ALL 3例。正常骨髓8例(份)，取自胸科非血液病手术患者肋骨。Raji细胞取自培养的对数生长期。

2DNA提取骨髓以肝素抗凝，经Ficoll液分选单个核细胞(MNC)后常规方法提取DNA^［2］；Raji细胞直接提取DNA。紫外分光光度计测定DNA含量，吸光度(A)₂₆₀／A₂₈₀≥1.8。

3PCR引物^［3］设计p15甲基化引物(p15M)及p15非甲基化引物(p15U)，两组引物由CybenSyn公司合成。其序列为：p15M sense:5′-CCCTTCGTATTTTGCGGTT-3′；p15M antisense:5′-CGTACAATAAACGAACGACCGA-3′，扩增产物148 bp。p15U sense: 5′-TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT-3′；p15U antisense:5′-CCATACAATAACCAAACAACCAA-3′，扩增产物154 bp。

4MSP^［3］

4.1DNA的NaHSO₃处理：取DNA 2 μg溶于25 μl水中，加入0.4 mol/L NaOH 25 μl，37 ℃ 10分钟；再加入10 mmol/L C₆H₆O₂ 30 μl及3 mol/L NaHSO₃ 520 μl，液体石蜡覆盖(隔离空气)，在50 ℃ 16小时反应后冷冻除去液体石蜡，以Wizard DNA Clean-up System除盐；加入等体积0.6 mol/L NaOH, 室温5分钟；再加入等体积6 mol/L NH₄Ac及二倍体积无水乙醇，-20 ℃过夜，12 000 r/min离心10分钟，得DNA沉淀，加入体积分数为70%的冷乙醇，12 000 r/min离心10分钟×2次，弃上清，得DNA沉淀，吹干，30 μl去离子水溶DNA，-20 ℃保存或直接做PCR。

4.2PCR：反应体系为40 μl，含1×缓冲液，MgCl₂ 6.7 mmol/L，引物1.5 pmol/L,dNTP (Promega公司) 1.25 mmol/L, NaHSO₃处理DNA约50 ng；96 ℃预变性5分钟，加入DNA聚合酶(Promega公司) 2.0 U。扩增条件：94 ℃ 45秒，60 ℃ 45秒，72 ℃ 45秒，35个循环，最后1个循环72 ℃延伸7分钟。

4.3MSP产物电泳分析及测序：将MSP产物与上样液按6∶1混合，于20 g/L琼脂糖凝胶上电泳，于凝胶成像系统(UVP，美国)下检测、照相。配制30 g/L的低熔点琼脂糖凝胶，将以p15M为引物的MSP产物与上样液6∶1混合后上样，电泳；以无菌刀片于紫外灯下切取阳性带，置于Eppendorf管中，加入等体积TE，60 ℃ 10分钟熔胶；加入1/10体积3 mol/L NaHAc,顺序以饱和酚、酚-氯仿(体积比为1∶1)、氯仿-异戊醇(体积比为25∶1)抽提，乙醇沉淀后得到MSP产物，电泳证实为所需片段，由中国科学院微生物研究所测定。

结果

1各型急性白血病p15的MSP结果40例初治或复发急性白血病患者MSP阳性率为80%(40例中32例阳性)，其中AML为83%(24例中20例阳性)，ALL为73%(15例中11例阳性)，两型间差异无显著性(P＞0.05)，1例粒淋混合型患者为MSP阳性(图1)；5例完全缓解的患者有1例阳性(该例阳性者不久白血病复发，最终死亡)。

M:Marker;1:AML,幼稚细胞98%；2：ALL，幼稚细胞52%；

3：AML-CR；Mp：引物为p15M；Up:引物为p15U

1急性白血病的p15 MSP

2细胞系及正常骨髓细胞的p15 MSP结果Raji细胞为阳性，8例(份)正常骨髓均阴性。

3MSP敏感度测定将Raji细胞的DNA以正常骨髓细胞的DNA稀释后再做MSP，结果显示MSP敏感度可达10^-3(图2)。

M：Marker;1～5：Raji细胞稀释至10⁰～10^-4；Mp：引物为p15M；Up：引物为p15U

2MSP敏感度测定

4MSP产物测序结果测以p15M为引物的MSP产物的一条链(相当于p15的antisense链)，结果显示，与p15原序列相比，G转化为A，而CG中G仍保持不变。

以p15M为引物之MSP产物部分序列与p15原序列的比较(划线及黑体示原序列中的G在MSP产物中转化为A)：

MSP产物序列：AACGCGCCTAATTTACTTCTAAAAAAAAAC

p15原序列：GGCGCGCCTA GATTGCTTCT

GGGAAAAAGC

MSP产物序列：GCCTAACGCGAACGCAACCG AACTCAAAAC

p15原序列：GCCTAGCGCG GACGCAGCCG

AGCTCAAAGC

MSP产物序列：CGCTCTAACC GCAAAATACGAACG

p15原序列：CGCTCTGGCC GCAGGGTGCGGACG

讨论

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