关键词： 细胞系；白血病；寡核苷酸类，反义；细胞分裂；细胞凋亡

【摘要】目的了解WT1反义寡核苷酸对白血病细胞增殖和凋亡的影响。方法应用WT1基因的反义寡核苷酸(WT1 ASO)处理K562、U937、HL-60细胞系，白血病患者以及正常人骨髓细胞，然后以台盼蓝拒染法、细胞集落法及流式细胞仪检测法确定白血病细胞的增殖和凋亡。结果WT1 ASO能够抑制WT1表达阳性的K562细胞生长，对WT1表达阴性的U937细胞则无抑制作用；WT1 ASO对8例急性髓系白血病患者中4例的白血病细胞集落(CFU-L)有显著抑制作用，对8例正常对照骨髓细胞的CFU-GM则无抑制作用；而WT1有义寡核苷酸(SO)对白血病细胞系、白血病患者的CFU-L以及正常对照骨髓CFU-GM均无抑制作用。WT1 ASO可以引起K562细胞的凋亡，随着作用时间的延长凋亡数增加，结合小剂量Vp16(10 μg/ml)后细胞凋亡率明显提高；HL-60细胞经WT1 ASO处理24小时及60小时均无明显凋亡，接近有义链组及对照组，但WT1 ASO与Vp16(10 μg/ml)联合处理60小时后细胞凋亡增加，大于单独应用Vp16及Vp16+SO引起的凋亡。结论WT1反义寡核苷酸对白血病细胞有特异的抑制作用，能够导致K562细胞凋亡，并可提高白血病细胞对Vp16的敏感性；WT1基因与白血病细胞增殖和凋亡有关。

Effect of WT1 antisense oligonucleotide on proliferation and apoptosis of human leukemia cells

WU Xiaoxiong,WANG Yuezeng, PEI Xuetao,et al.

General Hospital of PLA, Beijing100853

【Abstract】ObjectiveTo elucidate the effect of WT1 antisense oligonucleotide on and the role of WT1 gene in proliferation and apoptosis of leukemia cells.MethodsK562,U937,HL-60 cell lines, leukemic blast from 8 acute myeloid leukemia patients and normal bone marrow cells from 8 healthy subjects were treated in vitro with WT1 antisense oligonucleotide (WT1 ASO) targeting to the translation site of WT1 mRNA. The inhibitory effect on growth of leuekmia cells was measured by Trypan blue exclusion and colony-forming unit assay. Apoptosis was measured by flow cytometric analysis and DNA fragmentation assay.ResultsWT1 ASO significantly inhibited the proliferation of K562 cells expressing WT1 and leukemic blast of 4 in 8 acute myeloid leukemia patients, but didn't inhibit the growth of U937 cells which had no WT1 expression and CFU-GM of normal marrow cells from 8 healthy subjects. Whereas WT1 sense oligonucleotide (WT1 SO) had no effect on the proliferation of K562 cells, U937 cells and the CFU-GM of normal marrow cells. WT1 ASO could induce apoptosis of K562 cells and the level of apoptosis was increased markedly when combined with Vp16; WT1 ASO alone couldn't induce apoptosis of HL-60 cells, but could increase the apoptosis when combined with Vp16.ConclusionWT1 ASO specifically inhibit the growth of leukemic cells, induce apoptosis of K562 cells and increase the apoptosis susceptibility of leukemia cells to Vp16. WT1 plays an important role in proliferation and apoptosis of leukemic cells.

【Key words】Cell lineLeukemiaOligonucleotides,antisenseCell divisionApoptosis

Wilms肿瘤基因(WT1)位于染色体11p13，编码1个具有激活和抑制双重功能的转录调控蛋白。WT1可以作用于许多与造血细胞增殖和凋亡有关的基因，在不同的肿瘤发生和发展过程中起重要作用^［1，2］。WT1的表达具有一定的组织特异性，在大多数白血病细胞中高度表达，在成熟细胞中无表达或表达很低;WT1的表达与白血病患者的预后有关，提示WT1基因的异常表达与白血病发病可能有关^［3］。我们用WT1反义寡核苷酸(WT1 ASO)处理白血病细胞，然后测定其对白血病细胞增殖和凋亡的影响，以探讨WT1基因在白血病细胞增殖和凋亡中的作用。

对象和方法

1研究对象

1.1白血病细胞系：将白血病细胞系K562、HL-60、U937置于RPMI 1640全培养液中(含体积分数为15%的胎牛血清)，于37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中培养。每2～3天换液1次。

1.2白血病患者骨髓：急性髓系白血病患者8例，(其中1例为慢性粒细胞白血病急变)经骨髓细胞形态学及组织化学检查确诊，诊断均符合FAB诊断标准。骨髓采自化疗前。其中7例WT1表达阳性，1例未测。正常对照8例，骨髓取自胸外科非血液病患者的肋骨。

2引物合成由军事医学科学院合成，其序列^［4］为：

WT1反义链：5′-GTCGGAGCCCATTTGCTG-3′；

有义链：5′-CAGCAAATGGGCTCCGAC-3′

该反义链与WT1转录体翻译起始序列互补，每个碱基均经硫代修饰。

3分离单个核细胞(MNC)取患者或正常骨髓1～5 ml，肝素抗凝，加淋巴细胞分离液，1 800 r/min离心20分钟，取界面层MNC。

4WT1 ASO处理白血病细胞取倍数增长期白血病细胞或人骨髓细胞培养于RPMI 1640培养液中，调细胞浓度为2×10⁵/ml，接种至24孔板，加反义核苷酸(终浓度为120 μg/ml)，作用2小时后再加入人AB血清(体积份数为5%)。置37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中培养，以后每24小时加反义核苷酸(60 μg/ml)。同时设有义核苷酸(SO)组及对照组(只含全培养液)。白血病细胞以台盼蓝拒染法确定活细胞数。实验设4个复孔，重复4次独立实验。

5骨髓粒-巨噬细胞集落(CFU-GM)、白血病细胞集落(CFU-L)培养正常人或白血病患者骨髓MNC经WT1 ASO处理60小时后，在体外半固体培养体系中测定CFU-L和CFU-GM。

6实验结果以细胞相对存活数(率)或细胞集落数表示。

7细胞凋亡的测定

7.1流式细胞仪测定细胞凋亡：参照文献［5］。

7.2DNA琼脂糖凝胶电泳：1×10⁵细胞用PBS洗1次，加入细胞裂解液0.5 ml,0.15 mg/ml的蛋白酶K 10 μl，56 ℃作用3小时后离心(5 000 r/min)20分钟。提取上清加3倍无水乙醇(乙醇终浓度为体积分数75%)，加入2 mmol/L NaCl(终浓度为0.2 mmol/L)，置-20 ℃ 2～24小时，离心(12 000 r/min)15分钟，弃上清，用体积分数为75%的乙醇洗2次，吹干，用去离子水溶解。经琼脂糖凝胶电泳，紫外线透照，观察电泳条带并摄片。

8统计学处理可分析资料采用单因素卡方检验及t检验。

结果

1WT1 ASO对K562细胞WT1 mRNA表达的影响K562细胞经WT1 ASO (120 μg/ml)处理60小时后提取RNA，经RT-PCR检测WT1 mRNA^［3］，结果：将对照组WT1 mRNA的表达量定为1.0，ASO组WT1 mRNA的表达量为0.446，明显低于对照组；而SO组WT1 mRNA的表达量为0.942，接近对照组(图1)。

M：Marker；1：对照组；2：有义链组；3：反义链组

1K562细胞经WT1 ASO作用60小时后WT1 mRNA的表达

2WT1 ASO对K562、U937细胞系的选择性抑制作用WT1表达阳性的K562细胞经WT1 ASO处理60小时后，其相对存活率为(42.4±3.8)%，与SO组的(86.8±7.2)%相比，差异有显著性(P＜0.01)；WT1表达阴性的U937细胞经WT1 ASO处理60小时后，其相对存活率为(82.4±6.9)%，与SO组的(78.1±6.3)%相比，差异无显著性(P＞0.5)。

3WT1 ASO对白血病患者骨髓细胞CFU-L及正常骨髓细胞CFU-GM的作用WT1 ASO对8例白血病患者中4例的骨髓细胞CFU-L有明显的抑制作用，对7例WT1表达阳性患者进行组间分析，结果WT1 ASO对CFU-L的生长有明显的抑制作用，与SO组相比，差异有显著性(P＜0.05)。WT1 ASO及SO对8例正常骨髓细胞CFU-GM的形成均无抑制作用(集落数分别为98.9±14.3和102.5±13.1)，与对照组(105.1±16.9)相比，差异无显著性(P＞0.2)。

4WT1 ASO对K562细胞凋亡的影响WT1 ASO处理K562细胞24小时后，细胞凋亡率达14.6%，对照组和SO组只有2.3%和3.1%，ASO+Vp16组细胞凋亡率达到37.2%，高于SO+Vp16组及Vp16组(分别为12.8%和9.4%)；当WT1 ASO作用K562细胞60小时，诱导的细胞凋亡率达到26.8%，而对照组及SO组并无明显诱导凋亡的作用(分别为3.2%和3.9%)，ASO+Vp16组细胞凋亡率达66.6%，明显高于SO+Vp16组及Vp16组(分别为11.9%和12.1%)。

5WT1 ASO对HL-60细胞凋亡的作用