关键词： 受体，集落刺激因子；细胞株，U937；转录因子；信号肽类；磷酸化酶

【摘要】目的探讨人白血病细胞系U937的白血病抑制因子(LIF)受体α亚基和gp130亚基细胞内区与转录活性因子Stat3的活性关系，旨在研究白血病细胞增殖和分化的机制。方法用基因重组技术将2个基因在细胞内区截除（gp190EX、gp130EX）,并分别在U937细胞中表达，因其可与野生型受体竟争性结合LIF，故可用免疫印迹法分析受体细胞内区截除后Stat3的表达水平及该信号分子酪氨酸磷酸化。结果转染gp190EX和gp130EX的U937细胞Stat3表达量增加；Stat3酪氨酸磷酸化水平下降。结论LIF受体α亚基和gp130的细胞内区均参与了Stat3的激活和U937细胞的分化。

Signal of the cytoplasmic regions of leukemia inhibitory factor receptor(LIFR) α-subunit and gp130 involves Stat3 activation in leukemic U937 cells

LIU Houqi ，TANG Shuping，LIU Shanrong ,et al.

Histology and Embryology Department, Second Military Medical University, Shanghai200433

【Abstract】ObjectiveIn order to understand the mechanism of proliferation and differentiation of leukemia cells, we investigate the relation between the cytoplasmic regions LIFR α-subunit and gp130 and the transcription activator Stat3 in human leukemic U937 cells.MethodsThe cytoplasmic domain was each truncated from the LIFR α-subunit and gp130. The truncated forms of LIFR α-subunit(gp190EX) and gp130 (gp130EX) which can compete with the wild type receptor for binding to leukemia inhibitory factor (LIF) were expressed on the membrane of U937 cells.The level of Stat 3 and its phosphorylation were estimated by immunoblotting.Results The increased level of Stat3 and its decreased tyrosine phosphorylation were detected in each group of gp130EX and gp190EX as compared with that in the wild type receptor subunit group.ConclusionThe cytoplasmic domains of both LIFR α subunit and gp130 involve the induction of Stat3 phosphorylation in U937 cells.

【Key words】 Receptor,colony-stimulating factorCell line, U937Transcrption factorSignal peptidesPhosphorylase

白血病抑制因子（LIF），可调节多种细胞的生物活性^［1］。生物效应均有赖于其结合靶细胞膜上的LIF受体α亚基(gp190)，并使之与另一亚基（gp130）形成异源二聚体^［2］，从而使细胞内信号分子Stat3酪氨酸磷酸化^［3］。近来，有人证实gp130和gp190均存在着以酪氨酸为中心的官能团使Stat 3激活^［4］。然而，Minami在研究鼠白血病细胞系M1的分化机制中发现，LIF诱导M1细胞分化完全取决于gp130与Stat 3的结合，与LIF受体α亚基无关^［5］。因此，靶细胞膜上LIF受体与细胞内信号分子Stat 3的关系还存在疑点。我们以白血病细胞系U937为靶细胞，将改变后的LIF受体装配在细胞膜上,通过检测细胞内Stat 3酪氨酸磷酸化水平判断LIF受体2个亚基各自在U937细胞内启动细胞分化的作用。

材料和方法

1细胞人U937细胞株由上海第二军医大学长海医院临床免疫科沈茜教授提供，该细胞株用含体积分数为10%小牛血清的DMEM（Gibco）、37 ℃、体积分数为5%的CO₂条件下培养。

2LIF受体2个亚基细胞外区的分离以pKCSRα gp190 （LIF受体α亚基）和pRclgo gp130（Dr Moreau 提供）为模板，分别以SalⅠ、BamHⅠ 和SalⅠ/XhoⅠ、XbaⅠ 酶切，并装入pALTER。合成引物1（5′-CCATTCTCGTTTTCTAGAGCAAAGGAT- 3′）和引物2（5′-GTCTCGCTTTCTAGAGCAGAACAGCAC- 3′），并用Altered SitesⅡ突变系统（Promega）分别使两亚基的跨膜区与细胞内区之间产生XbaⅠ。然后，用XbaⅠ酶切后即可截去其细胞内区。最后，以XhoⅠ/SalⅠ、EcoRⅠ 及 PstⅠ/Hind Ⅲ、Xba Ⅰ 将两亚基的细胞外区和跨膜区基因从pALTER移至pED。

3癌基因c-myc多肽片段的制备人工合成2条寡聚核苷酸：5′-TCTAGAGAACAAAAACTGATTTCA-GAAGAAGATCTGTAGAATTCGC-3′；3′-TCTTGTTTTTGACTAAAGTCTTCTTCTAGACATCTTAAGCGCCGG-5′。并以1∶1比例混合后在94 ℃下反应5分钟，随之移至室温下让其缓慢复性。用Xba Ⅰ和EcoRⅠ 将其切成粘端后插入2个亚基的细胞外区和跨膜区基因之后。即在跨膜区后带上含12个氨基酸的c-myc 多肽片段（SREQKLISEEDL）。

4含LIF受体两亚基细胞外区基因逆转录病毒载体的U937细胞转染含gp190、gp130细胞外区基因的逆转录病毒载体pED(pED、190EX、pED-130EX)用脂质体转染法（Gibco BRL公司的Lipofectamine TM 和操作步骤）分别转染U937细胞。

5放射自显影法检测gp190EX、gp130EX基因的表达转染基因72小时后，更换无甲硫氨酸、无半胱氨酸的DMEM培养基，并加体积分数10%的透析后小牛血清，培养30分种，然后加5 550 kBq³⁵S（Amercham）继续37 ℃培养3小时，收集细胞。用冷冻PBS将细胞洗2次，然后按1×10⁶细胞加TBS（pH 7.4 Tris HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA）100 μl，其中含10 g/L TritonX-100，200 μmol/L PMSF（Sigma）、2 μmol/L抑酶醛肽、2 μmol/L抑蛋白酶肽（华顺试剂公司），在冰上反应20分种后4 ℃离心 12 000 r/min 20分种，取上清，加5 g/L去氧胆酸钠。每200 μl上清加入蛋白A-Sepharose 50 μl和正常血清20 μl,室温下混旋2小时,离心留上清再加蛋白A-Sepharose 50 μl和100 μl/ml抗myc单克隆抗体9E10继续反应2小时,而后留沉淀,用TBS洗一遍后进行80 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,用冰醋酸、甲醇固定，干燥机使凝胶干燥，最后压片-80 ℃曝光48小时。

6流式细胞仪(FCM)分析gp130EX、gp190EX在U937细胞膜的分布取5×10⁶细胞，用体积分数1%甲醛固定，然后经一抗为9E10，二抗为FITC-抗鼠IgG标记后上FCM检测（Becten Dickinson）。

7免疫印迹分析Stat3的表达和Stat3的酪氨酸磷酸化U937转染pED-190EX，pED-130EX，72小时后加入LIF(见文献［6］)100～250 μg/ml反应15～20分钟，收集细胞并裂解后收集上清（条件同前）。进行120 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用槽式转膜仪（TE52X Pharmacia Biotech）将蛋白转移到PVDF（Whatman）。兔抗Stat3 IgG（Santa Cruz）和鼠抗-磷酸化酪氨酸IgG（Pharmagene）分别与膜蛋白结合，碱性磷酸酶标记的抗兔IgG（Promega）和抗鼠IgG（华美公司）分别与一抗结合，BCIP/NBT作为酶标底物显色。

结果

1gp190EX、gp130EX的分离和c-myc寡聚核苷酸制备对分离后的gp190EX、gp130EX及c-myc寡聚核苷酸用全自动DNA测序仪分析均正确无误。

2gp190EX、gp130EX在U937细胞表达用脂质体将gp190EX、gp130EX cDNA转染于U937细胞，72小时后进行放射自显影检测（图1）和FCM分析（图2），利用c-myc 多肽与9E10抗体反应及gp190、gp130跨膜区将两外区锚在细胞膜上。结果证实两者已在U937细胞内表达，并准确装配在细胞膜上。

1： U937 转染gp190EX-myc；2：U937转染gp130EX-myc；

3：U937转染空载体；4：U937细胞；M：Marker

1放射自显影法测定gp190EX、gp130EX在U937细胞表达水平

a：U937转染gp190EX-myc；b,d：U937转染空载体；c：U937转染gp130EX-myc

2FCM分析gp190EX、gp130EX在U937细胞膜上的表达

3gp190EX、gp130EX对U937细胞Stat3表达的影响经证实U937细胞膜上已装配2个亚基细胞外区后，加入100～250 ng/ml LIF与细胞表面的野生型LIF受体亚基和gp190EX、gp130EX突变亚基结合形成二聚体（gp190-gp130EX，gp130-gp190EX），观察Stat3表达水平。结果Stat3表达在gp130EX组最高，而gp190EX组次之，均高于野生型受体亚基组（图3）。实验证明，gp130EX和gp190EX均能促进Stat3的表达，而gp130EX更为明显。因此，gp190或gp130的细胞内区缺如都会使细胞内Stat3代偿性增高。

1：U937细胞；2： U937转染190EX；3： U937转染130EX

3免疫印迹测定gp190EX、gp130EX转染U937后Stat3表达水平

4gp190EX、gp130EX使U937细胞Stat3酪氨酸磷