关键词： 细胞株，K562；信号传递；酪氨酸；磷酸化酶；砷剂

【摘要】目的进一步阐明As₂O₃诱导K562细胞凋亡和抑制其生长的可能机制，为As₂O₃在临床上的应用提供理论依据。方法采用免疫沉淀、Western blot、生物化学及免疫荧光等方法研究了As₂O₃对BCR/ABL蛋白酪氨酸磷酸化及其所介导的信号途径和某些凋亡相关蛋白表达的影响。结果1 μmol/L As₂O₃使细胞内多种蛋白酪氨酸磷酸化减少，而且BCR/ABL蛋白自身酪氨酸磷酸化亦减少，但0.1 μmol/L As₂O₃对蛋白酪氨酸磷酸化的影响不明显；As₂O₃对蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性未见明显影响；As₂O₃下调JAK2蛋白的表达，但对STAT1和STAT2蛋白的表达以及STAT1蛋白酪氨酸磷酸化无影响；As₂O₃亦不影响凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-x_L/S、Bax、ICH-1L、p53、PARP的表达，As₂O₃亦使K562细胞的PML蛋白降解。结论As₂O₃可能通过减少细胞内某些蛋白，尤其是BCR/ABL蛋白酪氨酸磷酸化和(或)下调JAK2蛋白的表达而干扰BCR/ABL致癌信号的传导，引起K562细胞凋亡和抑制其生长。

Effects of As₂O₃ on the BCR/ABL protein tyrosine phosphorylation in K562 cells

XIAO Dongmei, SUN Guanlin, SU Hui, et al

Shanghai Institute of Hematology, Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Second Medical University, Shanghai200025

【Abstract】ObjectiveTo explore the mechanisms of As₂O₃ inducing apoptosis and growth inhibition in K562 cells and provide theoretical basis for clinical application.MethodsThe effects of As₂O₃ on BCR/ABL protein tyrosine phosphorylation(PTP) and its signal transduction as well as the expression of apoptosis-related genes were studied by means of immunoprecipitation, Western blot, biochemical method and immunofluorescence.ResultsTyrosine phosphorylation of several cellular proteins especially BCR/ABL protein was decreased by 1 μmol/L As₂O₃, but not by 0.1 μmol/L As₂O₃. As₂O₃ had no effect on PTP activity, downregulated the expression of JAK2 protein, but did not affect the expressions of STAT1 and STAT2 proteins and the STAT1 protein tyrosine phosphorylation. As₂O₃ had no effect on the expression of the apoptosis-related genes like Bcl-2、Bcl-x_L/S、Bax、ICH-1_L、p53、PARP, either, but downregulated PML protein expression in K562 cells.ConclusionAs₂O₃ might induce K562 cell apoptosis and inhibit its growth by reducing tyrosine phosphorylation of cellular proteins especially BCR/ABL protein and/or by downregulating JAK2 protein expression to interfere with the BCR/ABL protein signal transduction.

【Key words】Cell line, K562Signal transductionTyrosine

PhosphorylaseArsenicals

K562细胞是一种建株于慢性粒细胞白血病(CML)急性变患者骨髓细胞的细胞株，具有Ph染色体和bcr/abl融合基因特征性标志。我们以前的研究发现As₂O₃能诱导K562细胞凋亡和抑制其生长，其机制可能与As₂O₃抑制细胞内某些蛋白,尤其是BCR/ABL蛋白的酪氨酸蛋白激酶(PTK)活性有关^［1］。本研究中我们进一步研究了As₂O₃对BCR/ABL蛋白酪氨酸磷酸化及其所介导的信号途径和某些凋亡相关蛋白表达的影响，以深入揭示As₂O₃对K562细胞的作用机制。

材料和方法

1细胞及其培养K562细胞培养方法同前。取指数生长期的细胞分别以2×10⁵/ml细胞浓度接种于含或不含As₂O₃或PTK抑制剂Genistein(Gibco)的新鲜RPMI 1640培养液中进行实验。

2STAT1、BCR/ABL及c-Abl蛋白的沉淀蛋白抽提及免疫沉淀的方法参照文献［1］。沉淀所得STAT1、BCR/ABL及c-Abl蛋白，再进行Western印迹法。

3Western印迹法方法同文献［1］。

4蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性的测定PTP活性测定所需蛋白的抽提法同前，但抽提液中不含钒酸钠。PTP活性检测试剂盒购于宝灵曼公司。具体操作按试剂盒说明书进行。每个实验重复3次，每次均设3个复管，并以蛋白抽提液代替抽提的蛋白做阳性对照，不加抗体孔为空白对照。PTP活性用阳性对照组吸光度(A)值-实验组A值表示。

5PML、BCR/ABL及c-ABL蛋白的分布与表达采用免疫荧光法。具体操作如下：收集细胞，PBS洗涤后，用细胞涂片仪(Shandon, 500 r/min,4分钟)涂片，自然晾干后以40 g/L多聚甲醛固定，以体积分数为100%甲醇再固定，1 g/L BSA封闭1小时，加1∶250抗c-ABL抗体(Santa Cruz产品)或抗PML抗体(日本名古屋大学医学院Naoe教授惠赠)，37 ℃放置1小时后以1∶10的FITC标记二抗(日本Naoe教授惠赠),37 ℃孵育1小时，荧光显微镜下观察结果。每个步骤后均用PBS洗涤3次。每次实验以PBS代替一抗为阴性对照。

结果

1As₂O₃对BCR/ABL蛋白酪氨酸磷酸化的影响经Western印迹技术，我们发现1.0 μmol/L As₂O₃能使细胞内相对分子质量为21.2万、18.0万、15.0万、12.5万及8.3万等蛋白的酪氨酸磷酸化减少，而0.1 μmol/L As₂O₃对蛋白酪氨酸磷酸化影响不明显(图1)。此外，还发现1.0 μmol/L As₂O₃和10.0 μg/ml Genistein均使BCR/ABL蛋白酪氨酸磷酸化减少，但As₂O₃的作用6小时开始减少，24小时完全消失，而Genistein作用12小时，BCR/ABL蛋白酪氨酸磷酸化已完全消失(图2)。

1～4：为1.0 μmol/L As₂O₃分别作用0，24，48，72小时；5～8：为0.1 μmol/L As₂O₃分别作用0，24，48，72小时

1As₂O₃对K562细胞BCR/ABL蛋白表达及其酪氨酸磷酸化水平的影响

1～6：为1.0 μmol/L As₂O₃分别作用0，6，12，24，48，72小时；7～9：为10.0 μg/ml Genistein分别作用12，24，48小时

2在As₂O₃和Genistein分别作用下K562细胞BCR/ABL蛋白表达及其酪氨酸磷酸化水平的变化

2As₂O₃对蛋白PTP活性的影响我们以前的研究结果显示，As₂O₃使蛋白PTK活性降低，减少蛋白酪氨酸磷酸化^［1］。我们进一步观察了As₂O₃对细胞总蛋白PTP活性的影响，发现1.0 μmol/L As₂O₃处理K562细胞12，24，48及72小时后，PTP活性未见明显的改变。

3As₂O₃对JAK及STATs蛋白表达的影响经免疫沉淀及Western印迹法，发现1.0 μmol/L As₂O₃和10.0 μmol/L Genistein均使JAK2蛋白表达降低，As₂O₃的作用随时间的延长虽稍有增强，但仍没有Genistein的作用明显(图3)。未发现As₂O₃及Genistein对STAT1蛋白表达及其酪氨酸磷酸化以及STAT2蛋白的表达有明显影响(图3，4)。

1～6：为1.0 μmol/L As₂O₃分别作用0，6，12，24，48，72小时；7～9：为10.0 μg/ml Genistein分别作用12，24，48小时

3As₂O₃和Genistein对K562细胞JAK2和STAT2蛋白表达水平的影响

1～4：为1.0 μmol/L As₂O₃分别作用0，24，48，72小时；5～7：为10.0 μg/ml Genistein分别作用12，