关键词： 大鼠，Wistar；受体，红细胞生成素；基因；聚合酶链反应

【摘要】目的检测大鼠骨髓细胞中新的红细胞生成素受体（EpoR）基因的可变剪切形式。方法对正常Wistar大鼠骨髓单个核细胞的总RNA进行逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），并测定扩增片段的序列。结果用一对引物（5′引物为637～657 bp，3′引物为882～903 bp）可扩增出两条片段，一条长约为267 bp，另一条为较长的片段。其中267 bp的片段为正常的EpoR扩增片段。测序结果显示，较长的扩增片段长度为346 bp，同样为大鼠EpoR核苷酸序列，但在736和737碱基之间插入了长度为79 bp的片段。经序列检索发现，79 bp的插入序列为滞留的第Ⅴ内含子，但在插入序列的第16位碱基由C突变为T，第49位和第50位碱基之间插入了G碱基。上述移码突变导致基因的阅读框架发生变化，在第7外显子出现终止密码子。结论在正常的Wistar大鼠中发现了新的、胞外近膜区、跨膜区和截短的胞内区编码序列发生变化的EpoR mRNA可变剪切形式。这一可变剪切形式的生物学意义有待于进一步研究。

A novel alternative splicing mode of the erythropoietin receptor gene in rats

LU Qiujun, YE Qinong, WEN Liqing, et al.

Department of Pharmacology and Toxicology, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing100850

【Abstract】ObjectiveTo detect new alternative splicing mode of erythropoietin receptor (EpoR)gene in normal rats. Methods Total RNAs were isolated from bone marrow mononuclear cells of normal Wistar rats.Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) of the total RNAs was done and the amplified products were sequenced. ResultsAfter RT-PCR with a pair of primers (sense: 637/657 bp, and antisence: 903/882 bp), two bands were detected， the expected band (267 bp) and a longer one (346 bp) which had a 79 bp insert between 736th and 737th bases from the first ATG of the rat EpoR nucleotide. Sequence analysis showed that the 79 bp insert was the retaining intron 5 with a C-to-T point mutation at 16th base and an insertion of G base between 49th and 50th base． The insertion of G base caused a shift in reading frame and resulted EpoR with a truncated intracellular domain.ConclusionA new alternative splicing of EpoR mRNA encoding truncated intracellular domain was identified in normal Wistar rats. Its implication in rat erythropoiesis remains to be determined.

【Key words】Rats,WISTARReceptor，erythropoietinGenePolymerase chain reaction

红细胞生成素受体(EpoR)基因的可变剪切在造血细胞中普遍存在，参与红系造血祖细胞的增殖、分化和凋亡等过程^［1］。文献报道在大鼠正常骨髓和脾脏细胞以及红白血病细胞株中EpoR存在胞外区插入105 bp的剪切形式，并提示这种剪切形式与红系造血细胞的增殖和分化有关^［2］。我们在研究EpoR基因表达时在正常的大鼠骨髓细胞中发现一种新EpoR基因剪切形式，现报告如下。

材料和方法

1动物Wistar大鼠(Rattus Norregicus)购自军事医学科学院实验动物中心，共6只，雌雄各半，体重140～160 g。

2骨髓有核细胞总RNA提取取正常Wistar大鼠双侧股骨，用生理盐水冲出骨髓细胞。再用4号半针头分散细胞。经淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，用生理盐水洗2次。按5×10⁶个细胞加1 ml Trizol试剂(Gibco BRL)，室温放置5分钟，加0.2 ml氯仿，振摇15秒，室温放置3分钟，2～8 ℃离心(12 000 r/min)15分钟，取上清加异丙醇0.5 ml，室温放置10分钟，2～8 ℃离心(12 000 r/min)10分钟。弃上清，用体积分数为75%的乙醇和无水乙醇各洗涤1次，20 μl 二乙基焦碳酸酯处理过的水溶解，用紫外分光光度计在260 nm处测定含量，10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的带型。

3逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR）检测总RNA在70 ℃水浴变性10分钟，取出后迅速放置于冰水中。cDNA第一链的合成体系如下：5 μg总RNA，1 mmol/L dNTP，50 U RNase抑制剂，200 U MMLV，4 μmol/L的EpoR的下游引物，10 mmol/L DDT和1×第一链缓冲液，用水补足20 μl体积。37 ℃ 1小时。上述EpoR下游引物序列为：ACCCTTGTGGGTGGTGAAGAGA。第二链合成体系如下：10 μl逆转录产物，各为0.5 μmol/L的EpoR上、下游引物，200 μmol/L dNTP，2.5 U Taq酶，2 mmol/L MgCl₂和1×第二链缓冲液，用水补至100 μl。PCR扩增条件：94 ℃预变性5分钟，94 ℃1分钟、60 ℃ 1分钟、72 ℃ 1分钟，进行35个循环，最后72 ℃延伸10分钟。EpoR的上游特异引物序列为ACGCGCTACACCTTCGCTGTT。

4琼脂糖凝胶电泳和序列测定取RT-PCR产物10 μl，用20 g/L琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后在透射紫外灯下观察并照相。同时进行低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收两条扩增带的cDNA，经纯化，克隆至pGEM-T载体，序列测定采用荧光标记全自动测序法。

结果

正常Wistar大鼠骨髓有核细胞总RNA的RT-PCR产物电泳结果显示，有两条明显的扩增片段，一条长约为267 bp，另一条为较长的片段(图1)。因上游引物位置在637～657 bp，下游引物位置在882～903 bp，故正常的EpoR扩增片段应为267 bp。序列测定结果显示：267 bp长的片段为大鼠EpoR cDNA的一段序列；另一较长的扩增片段长度为346 bp，同样为大鼠EpoR核苷酸序列，但在736和737碱基之间插入了长度为79 bp的片段，插入序列起始和终末碱基为GT和AG，符合GU-AG规则。经序列检索，发现79 bp的插入序列为第Ⅴ内含子滞留，但在插入序列的第16位碱基由C突变为T，第49位和第50位碱基之间插入了G碱基(图2)。结果导致插入序列及其后面序列的阅读框架发生移码突变，并在第Ⅶ外显子内出现终止密码子(UGA)。在蛋白水平，EpoR胞外近膜区、跨膜区和胞内区的氨基酸序列发生变化，胞内区截短。重复测序亦得相同的结果。共进行了6只大鼠骨髓有核细胞总RNA的RT-PCR, 结果一致。

M：分子量标准［pGEM-3Zf(+)/HaeⅢ］; R：大鼠

1大鼠骨髓单个核细胞总RNA RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

a：EpoR全长mRNA, Ⅰ～Ⅷ为外显子；b：截短EpoR mRNA, Ⅰ～Ⅷ为外显子，Ⅰ5为第5内含子；c：插入片段核苷酸序列，下划线的碱基为突变碱基或插入碱基

2大鼠EpoR基因组成和插入片段核苷酸序列

讨论

可变剪切是真核生物中普遍存在的调节基因表达的重要机制^［3］。文献报道截短型EpoR mRNA表达减少可能是真性红细胞增多症的发病机制^［4］。EpoR基因的可变剪切形式在人类和动物之间并不完全相同，有一定的种属差异，如小鼠EpoR mRNA的可变剪切主要有第Ⅴ内含子抑或第Ⅵ内含子的滞留^［5］，而在人类主要有第Ⅳ内含子或第Ⅶ内含子的滞留^［6］。本研究发现，大鼠EpoR mRNA存在内部有移码突变的第Ⅴ内含子滞留剪切形式。可变剪切种属差异的原因和意义尚待阐明。

EpoR胞质区不同结构域介导不同的功能^［7］。如在近膜区存在长度为96个氨基酸残基的两个保守序列：Box1和Box2，为促进细胞分裂信号转导和下游信号传递所必需。在EpoR胞质区远端存在一个负调节区，抑制由Epo诱发的细胞增殖。此外，胞质区内还有8个酪氨酸残基对EpoR介导的红系造血细胞的增殖和分化起着重要作用。由于滞留的第Ⅴ内含子内部有移码突变，使EpoR mRNA仅能编码316个氨基酸残基(正常为508个氨基酸残基)，可能会通过与全长的EpoR单链形成异二聚体，干扰正常的Epo诱发的信号转导，从而参与红系造血的调控。目前我们正在进行这种可变剪切形式对红系造血调控的研究，并检测在正常人中是否也存在这种类型的可变剪切。

参考文献

1Nakamura Y,Nakauchi H.A truncated erythropoietin receptor and cell death:a reanalysis.Science,1994,264:588-589.

2Fujita M,Takahashi R,Kitada K,et al.Alternative splicing of the erythropoietin receptor gene correlates with erythroid differentiation in rat hematopoietic and leukemic cells.Cancer Lett,1997,112:47-55.

3Benz EJ,Huang SC.Role of tissue specific alternative pre-mRNA splicing in the differentiation of the erythrocyte membrane.Trans Am Clin Climatol Assoc,1996,108:78-95.