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【摘要】目的观察体外富集的人外周血树突状细胞(dendritic cells, DC)的光镜形态学，细胞超微结构及细胞化学特征。方法取健康人新鲜外周抗凝血，采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞进行培养，经细胞因子(rhGM-CSF，rhIL-4，rhTNF-α)联合刺激培养9～12天，富集含DC的细胞群，光镜形态学分辨DC形态及含量，用抗人血DC表面特异单克隆抗体(mAb Ⅻ)确认DC的细胞化学特征。结果体外培养富集的人外周血DC群的DC含量达70%～80%。透射电镜观察表明，细胞因子诱导的人外周血DC群可见到两类DC亚群：一类可能来自DC前体细胞，其细胞表面有大量不规则树枝状突起(粗细不等)，细胞核不规则，核仁小，细胞化学染色［髓过氧化物酶(POX)、非特异性酯酶(NSE)］均为阴性；另一类是由单核细胞分化来的DC，细胞形态不规则，细胞表面粗糙，有大量皱褶及较粗大树枝状突起，胞核常呈现肾形或马蹄形，核内异染色质边集。结论细胞因子诱导的人外周血DC群存在多相性。
The cytologic ultrastructure and cytochemical features of human dendritic cells from peripheral blood
XIN Hong, CHEN Hu, MAN Qiuhong, et al.
BMT Center, Hemopoietic Stem Cell Lab, Bei Taiping Road Hospital, Beijing100039
【Abstract】ObjectiveTo observe the cytomorphological, cellular ultrastructure and cytochemical features of the dendritic cell (DC) enriched populations in vitro.MethodsFresh peripheral blood from healthy volunteers was collected and mononuclear cells (PBMC) were isolated on lymphocyte separating solution. The PBMC were cultured in mediums containing rhGM-CSF,rhIL-4 and rhTNF-α 9～12 days to generate DC-enriched populations，the morphological features and numbers of DC were identified and counted respectively by light microscope (LM) and confirmed by immunofluorescence assay (IFA),the ultrastructure characteristics of the DC populations were observed by transmission electron microscope, and the cytochemical features of them were also examined.ResultsThe percentage of DCs was 70%～80% in the DC-enriched populations as confirmed by IFA using mABⅫ. Transmission electron microscopy revealed that the DC populations contained two subsets of DC, one was considered as precursor cell derived DC(PC-DC), the cell surface of which had many irregular dendrites with a irregular nucleus, small nucleoli,numerous mitochondria, but scanty lysosomes, ribosome, rough endoplasmic reticulum and free polysomes. Cytochemical staining showed the DCs were both peroxidase (POX) and non-specific esterase (NSE) negative. The other was indentified as monocyte-derived DC(MO-DC), the features of which included: irregular shape, many ruffles and some rough lames on cell surfaces, nephritic or horseshoe nuclei with a thick rim of heterochromatin, numerous mitochondria, much more lysosomes, ribosomes, rough endoplasmic reticulum and Golgiosome. The cytochemical reactions indicated that most of them had POX-positive granules, and were NSE slightly positive.ConclusionCytokines in vitro induced DCs from human peripheral blood are heterogeneous.
【Key words】Dendritic cellsMicroscopy, electronHistocytochemistry
近年来有关树突状细胞(DC)在骨髓移植和肿瘤免疫中的重要作用越来越引起人们的关注。选择人外周血体外培养富集DC是研究DC的重要途径，但所面临的困难是DC在外周血中含量极微，而且DC的多源性和多功能性(不同分化程度的DC功能有所差异)尚待进一步阐明。我们借助于细胞因子［重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素(rhIL)4、重组人肿瘤坏死因子α(rhTNFα)联合应用］诱导体外培养富集人外周血DC群，所获取的DC群的DC含量达70%～80%，在此基础上通过透射电镜观察DC的超微结构和化学特征，描述了人外周血DC中存在两种DC群。
材料和方法
1细胞因子rhGM-CSF购自厦门特宝生物工程有限公司，rhIL-4由军事医学科学院生物工程研究所惠赠，rhTNFα购自北京邦定公司。
2Ⅻ单克隆抗体(mAb Ⅻ)是鼠抗人血DC的单克隆抗体(McAb)，分型为IgG1，是以富集的人血DC为免疫原制备的，购自法国Immunotech公司。mAbⅫ是专一抗人血DC表面特异抗原决定簇(这种抗原决定簇只存在于外周血DC前体，其它细胞上均无这种抗原，单核细胞不表达这种抗原)的McAb［2］。CD14McAb(抗单核细胞McAb)由荷兰TNO放射生物学研究所Bentvelzen博士赠送。
3健康人外周血取自本院骨髓移植中心，以淋巴细胞分离液(相对密度1.077，购自Sigma公司)常规密度梯度离心富集单个核细胞，RPMI 1640/HEPES(pH 7.2)洗细胞3次(洗尽血小板)，调整细胞数待用。
4DC的体外培养及富集人外周血单个核细胞(PBMNC)以合适的密度接种于塑料培养瓶内，培养用含体积分数为10%的小牛血清的RPMI 1640培养液，在体积分数为5%的CO2、饱和湿度及37 ℃的恒温箱中培养2小时后移弃未贴壁细胞(97%以上为T淋巴细胞)，用RPMI 1640液轻洗2遍贴壁细胞，在RPMI 1640完全培养液中继续培养24小时后按3×106细胞/10 ml培养瓶分组：将释放下来的悬浮细胞作为A组，仍然贴壁的细胞(主要为单核细胞)作为B组，A组及B组细胞均在含终浓度为500 U/ml的rhGM-CSF及rhIL-4的上述RPMI 1640完全培养液中培养，A、B组细胞在不含细胞因子的RPMI 1640培养液中培养作为A、B对照组。A组及B组均于培养第3天向培养瓶中添加rhTNFα(终浓度500 U/ml)，每天半量换液，每隔3天全量换液(含上述3种细胞因子的培养液)，必要时分瓶培养，于培养第9天及第12天收集DC群。对照组一直在不含细胞因子的RPMI 1640培养液中培养，同样换液，于培养第6天收集悬浮细胞。
5光镜观察细胞形态及细胞化学染色用离心涂片机(郑州医疗器械厂)制备细胞涂片，Wright-Giemsa染色，光镜观察DC形态。细胞化学染色按本实验室常规方法进行髓过氧化物酶(POX)，NaF敏感的α-萘酚醋酸(非特性)酯酶(α-NSE)的染色试验。
6免疫荧光(IFA)试验将细胞涂片空气干燥后用冷丙酮-20 ℃固定30分钟，用PBS洗3次，加一抗，37 ℃反应30分钟，PBS洗3次，再加荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的羊抗鼠IgG(军事医学科学院微生物流行病研究所制备)混匀，37 ℃反应30分钟后以PBS洗3次，在荧光显微镜下观察结果。
7透射电镜观察细胞超微结构于培养第12天收集足量A、B两组中由rhGM-CSF,rhIL-4,rhTNFα联合诱导的DC群，经PBS液洗2次后低速离心获细胞沉淀，以体积分数为25%的戊二醛4 ℃固定48小时后，再用10 g/L OsO4 4 ℃固定1小时，梯度乙醇脱水，EPON812包埋，超薄切片经醋酸铀-枸橼酸铅复染后，Philips EM-400T透射电镜观察并照相。
结果
1人外周血DC体外培养及富集A、B两组的对照(自然生长组)细胞呈圆形，在第1～4天细胞生长曲线平缓，第5天的细胞涂片经Wright-Giemsa染色，光镜下几个视野偶见1～2个DC，至第9天仅有少量活细胞。由rhGM-CSF,rhIL-4,rhTNFα联合诱导的A、B两组培养第2天细胞均呈明显的成簇聚团生长，培养第3～4天时倒置显微镜下可见大部分细胞呈梭形及不规则形状，细胞表面呈毛刺状，培养9天的A、B两组细胞均生长旺盛(100%活细胞，大部分细胞呈不规则形，并且伸出不规则突起)，将两组细胞涂片经Wright-Giemsa染色后光镜所见70%～80%细胞为典型DC形态(胞体至少为小淋巴细胞的3～4倍)，免疫荧光分析显示A、B两组大部分细胞与mAb Ⅻ呈阳性反应。
2人外周血DC群细胞超微结构将体外培养富集第12天的A、B组DC群样本在透射电镜下观察，每个视野充满DC，从亚细胞器的超微结构特征来看，DC群含两类DC：一类DC亚群在A组多见，其细胞表面有大量树枝状突起(粗细不等)，细胞核形状不规则，核仁小，核内异染色质沿核边高度凝聚，胞质中线粒体相当丰富，溶酶体、粗面内质网、多泡体、核糖体、胞饮小体数量少或无(图1a)，这类DC中个别细胞表面树突粗大者，其胞浆核内糖体及光面内质网清晰可见，部分内质网扩张或有些线粒体膨胀(图1b)，提示这些细胞活动度大、供能旺盛，我们分析这类DC可能源自DC前体细胞；另一类DC群在B组皆是，其细胞结构特征为细胞呈不规则形，细胞表面粗糙，有大量皱褶及粗大树枝结节状突起，细胞核常呈肾形或马蹄形，核内异染色质边集，胞浆内线粒体比第1类DC群相对少，高尔基体及板层溶酶体较多(图2a,b,c)，核糖体、粗面内质网相当丰富(图2b)，细胞表面及胞质近膜侧处常可见较多吞噬小体(图2d)，我们分析这些可能是由单核细胞分化来的DC的超微结构特征。
