关键词： 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；受体，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；信号传递；细胞,NIH3T3

【摘要】目的探讨人类粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体(GM-R)在NIH3T3细胞中表达的功能特性。方法将编码人GM-Rα和β亚单位的cDNA转染到无人GM-R表达的小鼠NIH3T3细胞中,并检测其阳性转染子在配体刺激后的增殖信号传导与酪氨酸磷酸化。结果重建的功能性GM-Rα／β可以介导细胞增殖与细胞集落形成，并诱导βc、Jak2、 Shc及Shc相关蛋白P145(SHIP)酪氨酸磷酸化，然而，人GM-CSF并不能激活仅含GM-Rα的NIH3T3细胞出现有丝分裂信号表达。结论人GM-Rα与β亚单位同时转染入NIH3T3细胞后，可通过βc磷酸化，激活Jak2 、Shc和SHIP信号传导途径，而导致配体依赖性细胞生长与集落形成。

Functional expression of human GM-CSF receptor in NIH3T3 cells

ZHANG Ri^*,FENG Yizhong,ZHU Ziling,et al.^*

Jiangsu Institute of Hematology,First Affiliated Hospital, Suzhou Medical College,Suzhou215006

【Abstract】ObjectiveTo characterize human GM-CSF receptor(GM-R) reconstituted in NIH3T3 cells.MethodsMouse NIH3T3 cells which do not express human GM-R were transfected with cDNAs encoding the α and β subunit of the human GM-R, and then ligand-stimulated proliferative signal transduction and tyrosine phosphorylation of the positive transfectants were examined.ResultsThe reconstituted functional receptor,GM-Rα／β,could mediate cell proliferation and colony formation in soft agar,and induce tyrosine phosphorylation of βc,Jak2,Shc and Shc-associated P145(SHIP). However,human GM-CSF did not activate mitogenic signal expression of NIH3T3 cells transfected with GM-Rα alone.Conclusions Introduction of both α and β subunit of human GM-R into NIH3T3 cells can result in ligand-dependent cell growth and colony formation via phosphorylation of βc and activation of Jak2,Shc and SHIP signal transduction pathway.

【Key words】Granulocyte-macrophage colony-stimulating factorReceptor,granulocyte-macrophage colony-stimulating factorSignal transductionNIH3T3 cell

人粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)可以刺激粒系造血祖细胞的增殖，并增强成熟中性粒细胞及单核细胞的功能。目前已知，GM-CSF的生物学作用是通过定位于细胞膜上的由α与β两个亚单位(β_C)共同组成的GM-CSF受体（GM-R）而介导的。近几年来，这一研究已经成为国际上研究的热点之一。我们用不含GM-R的非造血细胞NIH3T3，转染了GM-R基因，并对其功能表达进行了初步研究。

材料和方法

1试剂重组人GM-CSF及所用单克隆抗体(单抗)购自UBI公司；各种培养基、G418、湿性霉素B、lipofect AMINE及有关生化试剂购自Gibco公司；配制细胞裂解液的主要试剂购自Boehringer公司；同位素¹²⁵I-GM-CSF购自NEN公司；ECL药盒购自Amersham公司。

2表达GM-Rα及α/β的NIH3T3阳性克隆的建立按照脂质体转基因方法，将含人GM-Rα与β亚单位cDNA的质粒pMX-3622及CMV-β，分别转染到生长良好的NIH3T3细胞内，并用相应的抗生素G418和湿性霉素B筛选耐药克隆；待其克隆扩增后，按Eder等方法^［1］进行¹²⁵I-GM-CSF配体结合检测，以获得表达GM-Rα与α/β的阳性转染子。阴性对照采用未转染的NIH3T3细胞。

3细胞增殖功能检测取未转染和表达GM-Rα及α/β的NIH3T3细胞，按每孔5×10³/ml种植于含Opti-MEM低血清培养基的24孔板中，加入不同浓度GM-CSF和胎牛血清(FCS)，分别于培养的第2，4，6天用胰蛋白酶消化并计数细胞，每实验点设3孔，取均数作为结果。

4双层软琼脂集落培养参照Watanabe等方法^［2］，即在直径为60 mm的塑料培养皿中，预先制备含5.5 g/L 琼脂(Difco)的IMDM 2 ml作为培养底层，然后将含及不含人GM-R的NIH3T3细胞加入IMDM培养体系中，使每毫升体系含细胞5×10³、人表皮生长因子50 ng、人GM-CSF 100 ng、FCS体积分数为10%及琼脂3.3 g/L，上述体系混匀后，按3 ml/皿浇注于底层之上，置37 ℃、体积分数为5%CO₂及饱和湿度条件下培养1周，计数≥50个细胞的集落数。

5蛋白质免疫沉淀与Western blot分析将表达人GM-Rα/β的NIH3T3克隆在无血清IMDM培养基中过夜培养后，置冰上加100 ng/ml人GM-CSF刺激10分钟，用刮细胞器从培养皿底部刮出细胞，继以RIPA细胞裂解液在冰上裂解细胞30分钟，收集上清液，分别用抗β亚单位、抗胞浆蛋白激酶Jak2及Shc的单克隆抗体，按3 μg/ml浓度在4 ℃过夜进行免疫沉淀，然后加50 μg/ml蛋白G-Agarose培养6小时，即得所需的沉淀蛋白。将沉淀蛋白与50 μl 2×SDS样品缓冲液混匀并煮沸10分钟后，在75 g/L聚丙烯酰胺凝胶中电泳，经转膜与封闭后，与1 μg/ml抗磷酸化酪氨酸一抗(4G10)孵育2小时，再与1∶4 000稀释的羊抗鼠HRPO二抗孵育90分钟，最后按ECL试剂盒说明在X摄线胶片上显影。

结果

1GM-CSF刺激的细胞增殖在既无人GM-CSF也无FCS存在的条件下，转染与未转染的NIH3T3细胞在Opti-MEM培养基中均只能存活，不能增殖。当在Opti-MEM培养基中加入10 ng/ml人GM-CSF时，未见到GM-Rα克隆生长，仅发现共表达GM-Rα/β克隆出现增殖反应(见图1)。共表达GM-Rα/β克隆的有丝分裂与配体浓度有剂量相关性，在用5 ng/ml GM-CSF刺激时，即见细胞生长，当配体浓度达到100 ng/ml时，细胞生长达到最佳状态，进一步加大GM-CSF浓度，并不能使该克隆的细胞数目继续增多。FCS对GM-CSF的刺激活性具有协同作用，且单用体积分数为10%的FCS所产生的刺激效应,明显大于各种浓度配体所诱导的细胞增殖反应（见图2）。

图1重建人GM-R的NIH3T3细胞在10 ng/ml人GM-CSF

的无血清Opti-MEM培养基中的生长状态

2不同浓度人GM-CSF和FCS对表达GM-R α/β的

NIH3T3克隆生长的影响

2表达GM-Rα/β的NIH3T3细胞在配体诱导下的集落形成在双层软琼脂培养体系中，我们观察到在加入100 ng/mlGM-CSF后，含GM-Rα/β的NIH3T3细胞在培养7天时，每皿平均可出现150个集落，很多集落由≥200个细胞组成，少数集落甚至肉眼可见，随着培养时间的延长，集落数目未见进一步增加；未加GM-CSF时则无集落生长现象。

3含GM-Rα/β的NIH3T3细胞蛋白酪氨酸磷酸化经100 ng/ml GM-CSF刺激10分钟后，细胞出现了较强烈的胞浆蛋白酪氨酸磷酸化，分别见到相对分子质量为130×10³的βc及相对分子质量为100×10³的降解βc、相对分子质量为120×10³的Jak2和由相对分子质量为46×10³，52×10³和66×10³的3条区带组成的Shc及相对分子质量为145×10³的Shc相关蛋白SHIP表达，在未用配体刺激的阴性对照中，均无上述蛋白区带的出现（见图3）。

1：免疫沉淀；2，3：抗βc；4，5：抗Jak2;6,7:抗Shc

3共表达人GM-Rα/β的NIH3T3细胞在配体刺激后的胞浆蛋白酪氨酸磷酸化

讨论

我们在小鼠成纤维细胞系NIH3T3细胞中成功地重建了GM-R，并对其转染子的增殖、集落形成及胞浆蛋白酪氨酸磷酸化等功能进行了初步检测，结果发现，含GM-Rα/β的NIH3T3细胞在配体诱导下，可出现细胞增殖反应，且增殖反应在一定程度上具有剂量相关性，推测这与细胞膜上表达的重建受体分子与配体结合是否达到饱和状态有关。同时可见，血清具有协同GM-CSF刺激细胞生长的现象，这可能是血清中富含的运铁蛋白与胰岛素等细胞增殖必需成分作用的结果。

软琼脂集落培养结果显示，表达GM-Rα/β完整功能分子的NIH3T3细胞在100 ng/ml GM-CSF刺激下，可以出现细胞锚定生长，培养7天后的集落形成率达3%，这一结果与大多数报道相仿。至于有人未观察到集落形成，似与其转染子有丝分裂信号分子活化的水平较低或部分丢失有关^［1］。

与酪氨酸激酶受体不同，由于造血生长因子受体胞浆中缺少内在的酪氨酸激酶区