1概述

高铁血红蛋白血症是指血中高铁血红蛋白（methemoglobin）水平超过血红蛋白总量1%时的临床状态。按原因分为获得性和遗传性两大类。获得性高铁血红蛋白血症最常见，多为摄入某些氧化（还原）性药物或毒物时的一过性表现。遗传性高铁血红蛋白血症（hereditary methemoglobinemia，HM）绝大部分为NADH-细胞色素b5还原酶(NADH-cytochrome b5 reductase，b5R)的遗传缺陷所致，呈常染色体隐性遗传，故又称隐性先天性高铁血红蛋白血症（recessive congenital methemoglobinemia,RCM）;一小部分由血红蛋白先天异常（即血红蛋白M）引起，一般呈显性遗传。

b5R在体内有两种存在形式：胞浆可溶型和膜结合型。前者主要存在于红细胞，是红细胞高铁血红蛋白还原系统的主要成员，其活性占红细胞高铁血红蛋白总还原能力的2/3以上。膜结合型b5R广泛分布于组织细胞，参与多种生物化学活动，如脂肪酸代谢、胆固醇合成、药物生物转化。两种形式的b5R由同一个染色体单基因编码，胞浆可溶型含275个氨基酸残基; 膜结合型除含胞浆可溶型的275个氨基酸残基外, 氨基端还有一个由25个氨基酸残基组成的膜结合区。编码b5R的基因位于22号染色体，全长31kb，含9个外显子和8个内含子。

b5R缺陷导致的RCM可分成三型:Ⅰ型又称红细胞型，以发绀为主要临床表现，b5R活性降低仅限于红细胞,患者能应付较轻的体力劳动，寿命一般不受影响;Ⅱ型又称全身型，包括红细胞在内的全身细胞都存在b5R活性下降,临床上除发绀外，还伴有神经精神症状，患者一般在成年前夭亡;Ⅲ型为血细胞型,最少见,酶活力下降局限于血细胞。近年文献报道,Ⅲ型实际上与Ⅰ型是同一类型。

2研究历史

国内有关RCM的报道最早见于1954年，此后陆续有一些病例报告。1984年朱忠勇等报道了对b5R活性测定经典方法——Hegesh法的改进，从而在国内首先开始了对RCM的酶学研究。到90年代，国内开始了对RCM的分子生物学研究，目的主要是搞清中国人RCM患者b5R基因的突变情况。与此同时，为了阐明b5R基因发生突变时b5R含量与b5R活性的关系，还开展了相应的免疫学研究。目前，国内RCM研究正处于基础与临床并重、多种研究途径并举的局面。

3中国人RCM的分子基础

利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、PCR产物克隆测序和直接测序等现代分子生物学技术，南京军区福州总医院全军医学检验中心对9个Ⅰ型RCM家系若干患者的b5R基因突变进行了研究。在2个家系（福建省闽侯县）中发现b5R基因的第57位密码子存在CGG→CAG点突变（Arg→Gln）,两个家系（福建长乐市及三明市）b5R基因的第72位密码子存在CTC→CCC点突变（Leu→Pro),1个家系（浙江舟山）存在第203位密码子的TGC→TAC点突变（Cys→Tyr）。这三个密码子在人、大鼠和猪b5R上都是保守的。Arg57→Gln突变国外已先有报道，见于日本RCM患者。另外2种突变为新发现的b5R突变，推测它们对维持b5R的空间结构有重要作用： Leu72→Pro突变将破坏b5R的部分氢键结构，Cys203→Tyr突变使b5R仅有的4个Cys残基减为3个。以上3个突变序列均已在3个主要的国际基因数据库Genbank、EMBL和DDBJ登录。最近，该研究小组又在福建省宁德县发现1例同时具有第57位密码子和第203位密码子点突变的复合杂合子（compound heterozygote）RCM患者。

到目前为止，国内外共发现18种b5R基因突变，均位于染色体结构基因上，未见基因调控区突变；大多数突变发生在外显子上，少数在内含子上；突变类型以点突变为主，少数为缺失性突变。值得指出的是，Arg57→Gln突变在中国患者中的发现，使其成为到目前为止发现的唯一一种存在于不同国别和不同民族（中国和日本）RCM患者的突变类型。这一现象的意义尚待进一步研究。

上述突变中，第57位密码子的点突变使b5R基因上原有的一个Msp Ⅰ酶切位点消失，第72位密码子的点突变使b5R基因新增一个Apa Ⅰ酶切位点,第203位密码子的点突变使b5R基因出现一个Rsa Ⅰ酶切位点。根据上述突变对酶切位点的改变，我国学者建立了基于PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)的基因诊断方法，对相关家系的其它患者及亲属进行了基因诊断。

理论上，导致细胞b5R活性下降的直接原因涉及两个方面：b5R本身催化活力的下降和b5R含量减少。后者又包括b5R合成减少和降解增强两方面。国外利用基因工程技术表达b5R突变体，表明Ⅰ型RCM患者的b5R基因突变主要影响b5R对热和蛋白酶的稳定性，对酶本身的催化活力影响较轻。由于成熟红细胞寿命较长，又无蛋白质合成能力，故Ⅰ型患者b5R活性降低仅限于红细胞。Ⅱ型RCM患者的b5R基因突变使b5R本身的催化活力大为降低，累及全身细胞，但细胞的b5R含量不一定明显降低。最近, 王瑶等利用基因工程技术在大肠杆菌表达带第203位密码子点突变的b5R突变体获得成功,为深入研究该突变类型对b5R酶学性质的影响打下了基础。

4免疫学研究

为探讨b5R基因突变中细胞内b5R含量与活性间的关系，有必要使用免疫学方法对b5R进行定量测定。国外一直未建立抗b5R单克隆抗体，限制了免疫学方法的应用。兰风华等以重组人红细胞b5R(rb5R)免疫家兔和小鼠，按常规方法制备了兔抗人b5R多克隆抗体及目前国际仅有的两株b5R单克隆抗体（1E3，2B2）。利用多抗和单抗，建立了测定b5R含量的双抗体夹心ELISA法，并以此对30名正常成人和2个家系的4例RCM患者的红细胞b5R含量进行了测定。测得30名正常中国成人红细胞胞浆b5R含量的平均水平为（25.63±8.54）ng/mgHb,由此初步推算出该指标的参考值范围为≥11.62ng/mgHb。4例RCM患者的红细胞裂解液中检测不出b5R抗原（含量≤3.90ng/mgHb）。该组患者后来证明存在使b5R稳定性下降的Arg57→Gln突变，这与ELISA测定的结果相符。

研究表明,新生儿刚出生时红细胞b5R活性低于成人水平，一年内达到成人水平，但新生儿白细胞b5R活性与成人水平相近。这是新生儿更易发生中毒性高铁血红蛋白血症的原因。兰风华等利用前述ELISA法观察到，新生儿红细胞b5R含量明显低于成人水平，且含量低于成人水平的程度与b5R活性低于成人水平的程度相近。据此证明：b5R含量低是新生儿红细胞b5R活性低的直接原因。

5酶学和生物化学研究

朱忠勇等在对RCM的酶学研究中，首先对作为测定b5R活性经典方法的Hegesh法作了改进。特别是将原来的活性计算公式，即［（△A₅₇₅/min）×17］/A₅₄₀，修正为：［（△A₅₇₅/min）×16.2］/A₅₄₀。用改良Hegesh法对正常成人和新生儿红细胞、白细胞b5R活性进行了大量测定，并先后调查了9个Ⅰ型RCM家系的患者及亲属。先后两次测得正常中国人群（第1次101名，第2次81名）红细胞b5R活性的平均值为2.2U/gHb。观察到新生儿（脐血）红细胞的b5R活性明显低于正常成人水平，Ⅰ型RCM患者的红细胞b5R活性更低，甚至低到测不出。白细胞b5R活性与年龄无关，血细胞b5R活性与性别无关。黄长晖和俞秀玲等还摸索了从人红细胞及猪肝细胞分离纯化b5R的实验方法，回收率分别达20%和40%。以DCIP为底物对纯化的天然b5R进行了酶动力学研究，观察到在双倒数图上不同NADH浓度下的酶促反应曲线间呈平行关系，据此提出b5R酶催化反应可能呈“乒乓机制”（ping-pong mechanism）。

利用抗b5R抗体，兰风华等创立了一个对b5R活性进行定性和半定量测定的斑点法（spot test），即将b5R抗体点于硝酸纤维膜，以此捕获和富集待测液中的b5R，最后对b5R进行活性染色。该法简便、敏感、可靠、重复性好，适于大规模调查。对正常人、新生儿和RCM患者的检查结果与经典的b5R活性测定法一致。该方法不同于1970年Kaplan报道的斑点法,前者测定的完全是b5R活性,而后者测定的是红细胞的NADH-黄递酶(NADH-diaphorase)活性。

6流行病学观察

RCM在国外被列为罕见病，仅有500多例见诸报道。该病在国内的发病率可能比原先认识的要高。仅福建省即有6个RCM家系患者曾在南京军区福州总医院就诊，其中闽侯县2个，长乐市、三明市、宁德县和永泰县各1个。影响该病发病率统计的有以下3个因素：由于该病的突出表现是发绀，易被误诊为心肺疾病；大多数患者（Ⅰ型）能坚持日常生活和劳动，故求医愿望不积极；一部分患者（Ⅱ型）尚未得到确诊即在幼年夭折。

目前，国内尚未见Ⅱ型RCM的病例报道。

7问题与展望

基于流行病学观察，作者认为有必要对RCM在人群中的发病情况进行大规模调查。以往报道的b5R活性测定方法（分光光度、凝胶电泳）均不太适用于大规模调查。兰风华等创立的活性测定斑点法可能在这方面有独特优势。

同其他遗传病一样，目前对RCM尚无根治的办法，预防该病发生的首要环节在于防止有b5R基因缺陷的胎儿降生。因此，利用已取得的成果，开展RCM的产前诊断，特别是产前基因诊断将是今后RCM研究面临的重要课题之一。

RCM的基因治疗也是一个令人感兴趣的课题。一方面，人b5R基因是基因治疗的理想目标：b5R基因是典型的单拷贝基因，且目前发现的b5R基因突变均位于编码区，不涉及调控区；细胞对b5R表达量的要求不严格。但另一方面，对b5R基因缺陷进行基因治疗又面临一个棘手的问题：b5R在体内分布广泛，矫正部分细胞的b5R基因缺陷难以奏效。

基础研究方面，利用转基因（transgenic）和基因敲除（gene kn