关键词： 贫血,再生障碍性；造血干细胞；细胞分化

摘要目的研究再生障碍性贫血(再障)患者骨髓造血干/祖细胞的质量及其对不同造血生长因子的反应。方法①采用阴性选择法富集CD₃₄⁺细胞；②采用免疫荧光法检测15例再障患者骨髓富集前后CD₃₄⁺细胞百分率；③将富集后的细胞群在含不同的造血因子体系中培养，观察集落产率。结果①富集前正常对照组、重型再障(SAA)组、慢性再障(CAA)组骨髓单个核细胞(MNC)中CD₃₄⁺细胞百分率分别为(1.05±0.51)%、(0.70±0.37)%、(1.27±0.45)%,各组间比较,差异均无显著性(P＞0.05)；富集后正常对照组、SAA组和CAA组CD₃₄⁺细胞百分率分别为(17.7±9.7)%、(12.4±7.5)%和(17.1±11.2)%，各组间比较,差异均无显著性(P＞0.05)。②在培养体系中单独加入粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、白细胞介素3(IL-3)或加入G-CSF+SCF、GM-CSF+SCF、IL-3+SCF，结果再障组与正常对照组粒-巨噬细胞集落(CFU-GM)的数量和对不同造血因子的反应差异无显著性。③在培养体系中加入红细胞生成素(Epo)、Epo+IL-3和Epo+IL-3+SCF，红系爆式集落(BFU-E)和红系祖细胞集落(CFU-E)产率在再障组与正常组之间差异无显著性。④SCF能协同GM-CSF、G-CSF促进CFU-GM的生长,协同Epo、IL-3促进BFU-E、CFU-E的生长。结论再障患者骨髓CD₃₄⁺细胞百分率正常，造血干/祖细胞体外增殖分化功能无明显异常。

In vitro proliferation and differentiation of bone marrow stem cells of aplastic anemia patients

CHEN Guibin,SHAO Zonghong,JIA Hairong,et al.

Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital,CAMS and PUMC,Tianjin300020

AbstractObjectiveTo investigate the quality of bone marrow stem cells from aplastic anemia patients and their in vitro responses to hemopoietic growth factors(HGF).MethodsCD₃₄ positive bone marrow cells from 10 chronic aplastic anemia(CAA),5 severe aplastic anemia(SAA) patients and 5 healthy subjects were detected with immunoflurescence assay,enriched by Panning way,and then cultured in vitro for CFU-GM, BFU-E and CFU-E in the presence of recombinant HGFs.ResultsCD₃₄ positive rates of the bone marrow mononuclear cells(MNC) of CAA,SAA and control groups were (1.05±0.51)%, (0.70±0.37)% and (1.27±0.45)%, respectively,and there was no difference among them (P＞0.05).After being enriched,CD₃₄ positive cells in MNC of CAA,SAA and control groups increased to a similar level(P＞0.05).In the presence of G-CSF or GM-CSF,the enriched CD₃₄ positive MNC of CAA and SAA patients formed similar CFU-GM number to those of normal controls .The numbers of BFU-E and CFU-E formed from the enriched CD₃₄ positive MNC of CAA and SAA patients were also the same as that of normal control groups under the stimulation of erythropoietin and interleukin-3.Stem cell factor could cooperate with G-CSF,GM-CSF,and erythropoietin significantly increasing the numbers of CFU-GM,BFU-E and CFU-E of CAA,SAA and normal control’s enriched CD₃₄ positive MNC.ConclusionThe bone marrow CD₃₄ positive cells from aplastic anemia patients appears to be normal in percentages and in in vitro proliferation/differentiation capacities.

Key wordsAnemia,aplasticHematopoietic stem cellsCell differentiation

依据再生障碍性贫血(再障)患者骨髓单个核细胞(MNC)培养,红系及粒系集落数均少于正常人、干细胞移植可治愈部分再障患者及W/W^v小鼠造血干细胞膜上的c-kit受体蛋白表达异常等推测，再障的发病可能主要与造血干/祖细胞异常有关。但再障患者血清中可溶性干细胞因子(SCF)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和红细胞生成素(Epo)水平正常或高于正常^［1］，同时我们检测到再障患者骨髓造血干/祖细胞表面c-kit受体的表达正常或高于正常，表明再障患者SCF/c-kit受体的数量及其血清造血正调控因子水平无明显异常。再障患者骨髓MNC培养集落生长不良是否受MNC中除干/祖细胞以外的其它细胞影响？我们通过富集再障患者骨髓CD₃₄⁺细胞，体外在不同造血因子组合的体系中培养，观察红系和粒系集落产率，研究再障患者骨髓造血干/祖细胞体外增殖分化特征及部分造血因子受体的功能。

病例和方法

1病例来源

15例再障患者均为我院1997年6月～1998年10月住院患者，其中男性11例，女性4例，中位年龄43岁(8～62岁)。15例再障患者中慢性再障(CAA)10例，重型再障(SAA)5例，诊断符合全国再障诊断标准^［2］。5名健康志愿献髓者作为正常对照。

2试剂来源

所用抗T细胞(CD₃、CD₂)、NK细胞(CD₅₆)、B细胞(CD₂₀)、粒细胞(CD_11b)、红细胞(血型糖蛋白A-HIR2)抗体及其兔抗鼠二抗由我所免疫室提供。Epo、rhG-CSF、rhSCF、重组人白细胞介素3(rhIL-3)由麒麟公司惠赠，rhGM-CSF由先灵葆雅公司提供。

3实验方法

3.1标本的采集：无菌采集肝素抗凝再障患者骨髓8～10ml及健康志愿献髓者骨髓5ml，密度梯度离心法分离MNC。

3.2造血干细胞的富集：①去除单核细胞:采用粘附法去除MNC中的单核细胞,即为M^-MNC。②采用阴性选择法富集CD₃₄⁺细胞:用不同的单克隆抗体与M^-MNC反应，清除T、B淋巴细胞,成熟粒细胞,红细胞，即为富集后的造血干细胞(M^-Ab^-MNC)。

3.3CD₃₄⁺细胞的检测：采用免疫荧光法和流式细胞仪(美国BD公司，Vantagen)检测MNC和富集后M^-Ab^-MNC的CD₃₄^＋细胞百分率。

3.4体外生长特征分析：对M^-Ab^-MNC进行体外培养，观察体外长势。①粒-巨噬细胞集落(CFU-GM)：细胞浓度为1×10⁵/ml，在包含30g/L琼脂、体积分数为30％的小牛血清、68.4mmol/L谷氨酰胺的IMDM培养体系中单独加入造血生长因子G-CSF(40ng/ml)、GM-CSF(100ng/ml)、SCF(100ng/ml)、IL-3(40ng/ml)或不同组合的造血生长因子(G-CSF+SCF、GM-CSF+SCF、IL-3+SCF)孵育于体积分数为5％的CO₂孵箱，观察10～14天时集落和集簇数。②红系爆式集落(BFU-E)和红系祖细胞集落(CFU-E)：细胞浓度为2×10⁴/ml，在300g/L甲基纤维素、体积分数为10%的牛血清清蛋白、90.7mmol/L 2-巯基乙醇、体积分数为30％的小牛血清、68.4mmol/L谷氨酰胺的IMDM培养体系中，加入Epo(2U/ml)、Epo+IL-3(40ng/ml)和Epo+IL-3+SCF(100ng/ml)等造血生长因子培养于体积分数为5％的CO₂孵箱，观察BFU-E(10～14天)、CFU-E(5～7天)集落产率。

4统计方法

数据用±s表示，组间比较采用t检验。

结果

1一般临床资料

5例SAA和10例CAA患者入院时血红蛋白、中性粒细胞绝对值、血小板计数、网织红细胞计数分别为(71.0±23.7)g/L和(66.0±15.4)g/L、(0.32±0.11)×10⁹/L和(0.83±0.31)×10⁹/L、(12.0±9.1)×10⁹/L和(23.0±13.4)×10⁹/L、(3.5±1.4)×10⁹/L和(17.2±12.8)×10⁹/L；检查5例SAA患者无论髂骨和胸骨骨髓涂片增生程度均为重度减低，粒、红系分别占0.125±0.046和0.070±0.043，巨核细胞平均1个/片(0～2个/片);而10例CAA患者只有3例骨髓增生程度重度减低，粒、红系分别占0.285±0.132和0.115±0.089,巨核细胞平均4个/片(0～7个/片)。

2CD₃₄⁺细胞的检测

2.1骨髓MNC CD₃₄^＋细胞百分率：正常对照组、SAA组、CAA组骨髓MNC中CD₃₄⁺细胞百分率分别为(1.05±0.51)%、(0.70±0.37)%、(1.27±0.45)%,各组间比较,差异无显著性(t值分别为2.14,0.81,1.67；P＞0.05,)。

2.2富集后CD₃₄⁺细胞百分率：应用阴性选择法富集分离CD₃₄⁺细胞，正常对照组、SAA组和CAA组富集后CD₃₄⁺细胞百分率分别为(17.7±9.7)%、(12.4±7.5)%和(17.1±11.2)%，各组间比较,差异无显著性(t值分别为0.79,1.98,1.77；P＞0.05)