关键词： 贫血,再生障碍性；造血干细胞；受体，c-kit

摘要目的观察再生障碍性贫血(再障)患者骨髓造血干/祖细胞c-kit受体(CD₁₁₇)的表达，以了解再障造血功能衰竭与c-kit受体水平间的关系。方法采用免疫荧光法及流式细胞技术检测20例再障患者骨髓单个核细胞(MNC)和CD₃₄⁺细胞CD₁₁₇的表达水平。结果 ① MNC CD₁₁₇表达率慢性再障(CAA)组为(2.08±1.96)%、重型再障(SAA)组为(0.89±0.32)%、正常对照组和增生性贫血组分别为(0.45±0.16)%和(0.67±0.39)%，CAA组和SAA组明显高于正常对照组和增生性贫血组(P＜0.05)；②CD₃₄ CD₁₁₇双阳性细胞百分率，CAA组、SAA组、正常对照组和增生性贫血组分别为(0.87±0.57)%、(0.65±0.41)%、(0.41±0.15)%和(0.46±0.26)%，CAA组和SAA组明显高于正常对照组和增生性贫血组(P＜0.05)；③ CD₃₄^＋细胞群CD₁₁₇的表达，CAA组、SAA组、正常对照组和增生性贫血组分别为(71.6±12.4)%、(88.9±23.5)%、(46.3±9.7)%和(41.8±10.3)%，CAA组和SAA组明显高于正常对照组和增生性贫血组(P＜0.01)。结论再障患者骨髓干/祖细胞表面c-kit受体蛋白的表达高于正常对照，再障造血功能衰竭并非c-kit受体低表达所致。

Expression of c-kit receptor on the hemopoietic stem/precursor cells of aplastic anemia patients

SHAO Zonghong,CHEN Guibin,ZHANG Hong,et al.

Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital,CAMS and PUMC,Tianjin300020

AbstractObjective To explore the expression of c-kit receptor(CD₁₁₇) on the hemopoietic stem/precursor cells of aplastic anemia patients and its role in the genesis of aplastic hematopoiesis failure.Methodsc-kit expression on the bone marrow mononuclear cells(MNC) and CD₃₄ positive cells from 11 chronic aplastic anemia(CAA),9 severe aplastic anemia(SAA),10 non-aplastic anemia(NAA) patients (5 iron deficiency anemia and 5 autoimmune hemolytic anemia) and 5 healthy controls was measured with flow cytometric immunofluorescence assay and anti-CD₁₁₇ monoclonal antibody.ResultsThe CD₁₁₇ positive rates of MNC in CAA,SAA,NAA and control groups were (2.08±1.96)%, (0.89±0.32)%, (0.67±0.39)% and (0.45±0.16)%,respectively,and the rates were significantly higher in CAA and SAA groups than in NAA and control groups(P＜0.05).The CD₁₁₇ and CD₃₄ double positive cells of MNC in CAA,SAA,NAA and control groups were (0.87±0.57)%,(0.65±0.41)%,(0.46±0.26)% and (0.41±0.15)%,respectively,and were significantly higher in CAA and SAA groups than in NAA and control groups (P＜0.05).The CD₁₁₇ positive cells of CD₃₄ positive cells were also higher in CAA［(71.6±12.4)%］ and SAA［(88.9±23.5)%］ groups than in NAA［(41.8±10.3)%］ and control［(46.3±9.7)%］ groups (P＜0.01).ConclusionHemopoietic stem/precursor cells of aplastic anemia patients expressed more c-kit receptors than those of NAA patients and healthy controls.The hematopoiesis failure occurred in aplastic anemia is not attributed to low expression of c-kit receptor on the hemopoietic stem/precursor cells.

Key wordsAnemia,aplasticHematopoietic stem cellsReceptor,c-kit

c-kit受体(CD₁₁₇)被证明为干细胞因子(SCF)受体，表达于CD₃₄^＋的造血干/祖细胞(包括多能干细胞、红系祖细胞、髓系祖细胞、巨核细胞等)、CD₁₆^-CD₅₆⁺的NK细胞及CD₁₄⁺巨噬细胞等^［1］。正常骨髓单个核细胞(MNC)中1%～4%的细胞表达CD₁₁₇抗原，40%～60%的CD₃₄⁺细胞表达CD₁₁₇抗原。依据c-kit受体表达与否及其表达强度可将CD₃₄⁺细胞分为三群，即CD₃₄⁺c-kit^-、CD₃₄⁺c-kit强阳性(CD₃₄⁺c-kit^high)和CD₃₄⁺c-kit弱阳性(CD₃₄⁺c-kit^low),长期液体培养(LTC-IC)和集落培养结果表明：粒-巨噬细胞集落形成细胞(GM-CFC)主要为CD₃₄⁺c-kit^high，而CD₃₄⁺c-kit^low在形态学方面更似原始细胞，集落培养时不仅有GM-CFC生长，而且也形成红系爆式集落(BFU-E)^［2］。80%的原发性急性髓系白血病和慢性髓系白血病表达CD₁₁₇抗原，极少数急性T淋巴细胞白血病亦表达CD₁₁₇抗原，CD₁₁₇可作为检测急性髓系白血病微小残留病的标志^［3］。c-kit受体的表达与先天性纯红细胞再生障碍性贫血(Diamond-Blackfan anaemia, DBA)发病关系尚无一致的结论，部分研究表明,DBA患者c-kit受体蛋白表达正常或略高于正常，也有报道DBA患者c-kit受体的表达明显减少，而且与病情进展密切相关^［4,5］,但c-kit受体与初诊的获得性再生障碍性贫血(再障)的关系至今尚未见报道。我们通过检测再障患者骨髓干/祖细胞c-kit受体的表达，探讨c-kit受体在再障发病中的作用。

病例和方法

1病例来源

所有患者均为我院1997年6月～1998年12月的住院患者，20例再障患者中男性14例，女性6例，中位年龄38岁(8～62岁)，其中9例为重型再障(SAA),11例为慢性再障(CAA)。10例增生性贫血（自身免疫性溶血性贫血5例、缺铁性贫血5例）和5名健康志愿献髓者作为正常对照。诊断均符合全国血液病诊疗标准^［6］。

2试剂来源

实验所需主要试剂荧光素藻红蛋白(PE)标记的单克隆抗体c-kit受体(c-kit-PE)购于PharMingen公司，单克隆抗体CD₃₄和荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的“二抗”由我所免疫室提供。

3实验方法

取再障患者骨髓8～10ml，其它待测组(正常对照组和增生性贫血组)骨髓4ml，密度梯度法分离MNC，取1×10⁶ MNC加入CD₃₄单克隆抗体，4℃孵育30分钟，用含15.4mmol/L叠氮钠的PBS洗2次，加入FITC标记的“二抗”,4℃30分钟后，用含15.4mmol/L 叠氮钠的PBS洗3次，加入c-kit-PE, 4℃孵育30分钟，用含15.4mmol/L 叠氮钠的PBS洗2次后用流式细胞仪(美国BD公司，FACS Vantagen)计数2×10⁵个细胞，并计算CD₃₄、c-kit受体单阳性及双阳性细胞数。

4统计学处理

数据以±s表示，组间比较采用t检验。

结果

1一般临床资料

9例SAA和11例CAA患者入院时血红蛋白分别为(71.0±23.7)g/L和(66.0±15.4)g/L，中性粒细胞绝对值(ANC)分别为(0.32±0.11)×10⁹/L和(0.83±0.31)×10⁹/L，血小板计数分别为(12.0±9.1)×10⁹/L和(23.0±13.4)×10⁹/L,网织红细胞计数分别为(3.5±1.4)×10⁹/L和(17.2±12.8)×10⁹/L；骨髓涂片检查5例SAA患者无论髂骨和胸骨增生程度均为重度减低，粒、红系比值分别为0.125±0.046和0.070±0.043，巨核细胞平均1个/片(0～2个/片)，而10例CAA患者只有3例患者骨髓增生程度重度减低，粒、红系比值分别为0.285±0.132和0.115±0.089,巨核细胞平均4个/片(0～7个/片)。

2CD₁₁₇抗原表达率

MNC CD₁₁₇抗原表达率在CAA组、SAA组、正常对照组和增生性贫血组分别为(2.08±1.96)%、(0.89±0.32)%、(0.45±0.16)%和(0.67±0.39)%。经统计学处理显示，CAA组、SAA组骨髓CD₁₁₇抗原阳性细胞百分率较正常对照组和增生性贫血组明显增高(P值均＜0.05)，但CAA组和SAA组之间、正常对照组和增生性贫血组之间比较，差异无显著性(P值均＞0.05)。

3CD₃₄ CD₁₁₇ 双阳性细胞数

CD₃₄⁺CD₁₁₇⁺细胞百分率CAA组为(0.87±0.57)%、SAA组为(0.65±0.41)%、正常对照组为(0.41±0.15)%、增生性贫血组为(0.46±0.26)%，无论是CAA组，还是SAA组，其CD₃₄ CD₁₁₇双阳性细胞数明显高于正常对照组和增生性贫血组(P值均＜0.05)，但CAA组和SAA组之间、正常对照组和增生性贫血组之间比较,差异无显著性(P值均＞0.05)。

4CD₃₄⁺细胞群CD₁₁₇